論文の公開元へLucilactaene 生産糸状菌における二次代謝産物の生合成遺伝子と代謝産物の解析
概要
Lucilactaene 生産糸状菌における
二次代謝産物の生合成遺伝子と
代謝産物の解析
埼玉大学大学院理工学研究科 (博士課程後期)
理工学専攻(指導教員 長田裕之)
学籍番号 16DB054
氏名
加藤 翔
2020 年 3 月
1
略語一覧
DNA・・・Deoxyribo Nucleic Acid
Luc1・・・Lucilactaene biosynthetic gene 1
Luc2～8 も同様
NMR・・・Nuclear Magnetic Resonance
COSY・・・Correlation Spectroscopy
Fus9・・・Fusarin C biosynthetic gene 9
HRESITOFMS・・・High Resolution Electrospray Ionization Time of Flight Mass
Spectrometer
calc’d・・・calculated
MeOH・・・Methanol
IR・・・Infrared Spectroscopy
ATR・・・Attenuated Total Reflection
DEPT・・・Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
HSQC・・・Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy
HMBC・・・Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy
PacC・・・Plasma membrane complex C
AreA・・・Ammonium repressible A
CreA・・・Carbon catabolite repression A
cAMP・・・cyclic AMP
HOG・・・High osmolarity glycerol
Tor・・・Target of rapamycin
HDAC・・・Histone Deacetylase
PKS-NRPS・・・Polyketide synthase-Non ribosomal peptide synthetase
DH・・・dehydrogenase
P450・・・P450 monooxgenase
MT・・・Methyltransferase
MIC・・・Minimum Inhibitory Concentration
HPLC・・・High Performance Liquid Chromatography
PDA・・・Potato Dextrose Agar
FUSS・・・fusarin C biosynthesis PKS-NRPS
ATMT 法・・・Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation 法
UPLC/MS・・・Ultra Pressure Liquid Chlomatography / Mass Spectram
HRMS・・・High Resolution Mass Spectrometer
EtOAC・・・ethyl acetate
2
MeCN・・・acetonitrile
fr・・・fraction
YSA・・・Yeast Sucrose Agar
DMSO・・・Dimethyl Sulfoxide
ROS・・・Reactive oxygen species
UV・・・Ultraviolet
LaeA ・・・Loss of aflR expression A
Lae1・・・Loss of aflR expression 1
UPR・・・Unfolded Protein Response
RNA-seq・・・Ribonucleic acid-sequencing
BLAST・・・Basic Local Alignment Search Tool
US・・・Upstream Sequence
DS・・・Downstream Sequence
TF・・・Transcriptional Factor
Km50・・・kanamycin 50 μg/ml
hph・・・hygromycin phosphotransferase
genr・・・geneticin resistance gene
hyg・・・hygromycin B
hyg500・・・hygromycin B 500μg/ml
HMG-CoA・・・3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A
PCR・・・Polymerase chain Reaction
ORF・・・Open Reading Frame
gDNA・・・genome DNA
KS・・・ketosynthase
AT・・・acyltransferase
DH・・・dehydrogenase
ER・・・enoylreductase
KR・・・ketoreductase
cMT・・・c-Methyltransferase
Myb・・・myeloblastosis
TPM・・・Transcripts Per Kilobase Million
LB 培地・・・Luria-Bertani 培地
TE・・・Tris-EDTA
SOC・・・Super Optimal broth with Catabolite repression
OD・・・Optical density
IM・・・Induction medium
3
CCM・・・co-cultivation medium
As500・・・Acetosyringone 500 µg/ml
Carb・・・Carbenicillin 500 µg/ml
MES・・・2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid
PDB・・・Potato Dextrose Broth
OM・・・Oatmeal
CPC・・・Centrifugal Partition Chromatography
FBS・・・Fetal Bovine Serum
DMEM・・・Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
RPMI・・・Roswell Park Memorial Institute medium
HEPES・・・4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthaneSulfonic acid
LDH・・・Lactate Dehydrogenase
Tris・・・Tris(hydroxymethyl)aminomethane
4
目次
序章
序論
第1章 Lucilactaene の生物活性の解析
第1節
研究の目的と背景
第2節
Lucilactaene、NG-391、peak 3 の精製
第3節
Peak 3 の構造決定
第4節
lucilactaene 類縁体の生物活性評価
第5節
考察
第2章 タンパク質合成阻害剤 hygromycin B 処理による二次代謝産物生産誘導の解析
第1節
研究の背景と目的
第2節
タンパク質合成阻害剤 hygromycin B による二次代謝産物の生産誘導
第3節
Hygromycin B 処理時の生育阻害試験
第4節
Hygromycin B 処理したプレートの代謝物解析
第5節
赤色色素の解析
第6節
1233A と 1233B の同定
第7節
生産誘導された二次代謝産物の生物活性
第8節
考察
第3章 生産誘導される化合物の生合成遺伝子クラスターの解析
第1節
研究の背景と目的
第2節
RNA-seq を用いた hygromycin B 処理による二次代謝産物生合成遺伝
子群の解析
第3節
Fusarubin 生合成遺伝子クラスターの解析
第4節
1233A 生合成遺伝子クラスターの解析
第5節
HMG-CoA 合成酵素の解析
第6節
考察
第4章
実験方法
第5章
参考文献
第6章
謝辞
5
序章
序論
微生物の生産する二次代謝産物は様々な構造を有し、その生理活性は長きにわたり新
薬の探索源となっている。Statin や penicillin などが有名で幅広く人類に貢献し、さら
に生命現象を解き明かすためのバイオプローブとしてケミカルバイオロジー研究に用
いられてきた 1。近年、ゲノム情報が解析されたことにより、微生物は想像以上に多く
の二次代謝産物生産に必要な遺伝子を持つことが明らかとなってきた 2。しかし、実験
室環境下で利用できる二次代謝産物はごく一部であり、多くの二次代謝産物生合成遺伝
子は休眠状態である。そのため活用されていない二次代謝産物は多く残されている 3。
これまでに様々な二次代謝の活性化手法が報告されているが、これらを駆使したとして
もすべての二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの代謝産物が生産されるようになる
わけではない。今でもなお、二次代謝産物の活性化手法は求められている。本手法を発
展させるためには、新たな二次代謝の活性化手法が必要不可欠である。
Fusarium 属は糸状菌の一種であり土壌環境中で分解者として働いているだけでは
なく、植物病害を引き起こし、感染過程の途中にカビ毒を生産し、病気やアレルギー性
疾患などの原因となる。 Fusarium 属の生産する二次代謝産物は gibberellins4 、
fusarisetine5、fusaric acid6、bikaverin7、fujikurins8、acorenol9 などが明らかとなっ
ている。解析が進んでいる生物種のうち Fusarium fujikuroi では全二次代謝生合成遺
伝子クラスター中の 6 割が生産物と生合成遺伝子が紐づいている 10。
糸状菌 Fusarium sp. RK97-94 は理化学研究所の長田抗生物質研究室により、長崎県
稲佐山にて採取された糸状菌である。変異型温度感受性 tsp53 を導入したヒト非小細胞
肺がん H1299 細胞（H1299/tsp53 細胞）に対して細胞周期を G1 期で停止させる活性
を示す抗がんリード化合物 lucilactaene (1) を生産する 11。同時に NG-391 (2) という
生合成中間体が生産されることが明らかとなっている。ドラフトゲノム解析によると、
二次代謝産物生合成遺伝子クラスターは 42 個存在していることから、未利用の二次代
謝産物が多く残されていることが示唆されていた。本菌の二次代謝産物と生合成遺伝子
クラスターを詳細に解析することは、未知の二次代謝産物の発見や、新たな生合成遺伝
子クラスターの同定に繋がる可能性がある。本研究では lucilactaene のさらなる生理活
性の解析を行った。また lucilactaene 生産菌において hygromycin B による二次代謝産
物の生産誘導の現象を見出し、生産誘導されてきた二次代謝産物の詳細な解析を行った
6
第1章
Lucilactaene の生物活性の解析
1-1 研究の目的と背景
発がんの過程で高頻度に変異が認められるがん抑制遺伝子である p53 は、発がんの抑制
に重要な役割を果たし、DNA 損傷、熱ショック、低酸素状態などさまざまなストレスやが
ん遺伝子の活性化などの刺激により誘導される 12, 13。誘導された p53 は、DNA 配列特異的
な転写調整因子として働き、細胞周期停止や、DNA 修復、アポトーシスなどを引き起こす。
p53 は多くのヒトがん細胞において欠損あるいは変異している。そのため、p53 の欠損ある
いは変異したがん細胞において変異型 p53 を正常型へと機能回復させる化合物や、p53 非
依存的に p53 の下流因子を活性化させて細胞周期停止やアポトーシスを誘導する化合物は、
抗がん剤のリード化合物になりうると考えられる 14, 15。
Lucilactaene (1) は、理化学研究所の長田抗生物質研究室により、長崎県稲佐山にて採取
された糸状菌 Fusarium sp. RK97-94 の培養液から、変異型温度感受性 p53 を導入したヒ
ト非小細胞肺がん H1299 細胞（H1299/tsp53 細胞）において p53 非依存的に細胞周期を
G1 期で停止させる活性を指標に見出された低分子化合物である 11。また、lucilactaene の
類縁体である NG-391 (2) は神経成長因子産生促進作用及び神経栄養因子作用を有するこ
とが報告されている 16。しかしながら、lucilactaene (1) 及び NG-391 (2) の微生物やほか
のがん細胞種への活性や機能について未知の部分が多く残されている。
そこで、lucilactaene 生合成遺伝子クラスターを単離し、遺伝子破壊株を作製し生合成中
間体を取得することと、lucilactaene (1) と NG-391 (2) と生合成中間体を用いて生理活性
を解析し構造活性相関により活性に重要な部位を明らかにすることを目的とした。
Fig. 1-1 Lucilatcaene、NG-391、fusarin A、fusarin C の化学構造
7
1-2. Lucilactaene、NG-391、peak 3 の精製
微生物やほかのがん細胞種への活性については検討されていないことから、その生物
活性を更に解析するために、lucilactaene (1) と NG-391 (2) を精製した。
Lucilactaene 生産菌 Fusarium sp. RK97-94 株を 2 L の FDY 培地で培養し、エキスから
lucilactaene (1) を 2 mg、NG-391 (2) を 20 mg 取得した (Fig. 1-2)。
Lucilactaene (1) の生合成遺伝子の解析より、Luc1 がメチル基転移酵素と機能予測され
ていた。luc1 株の代謝物解析により、新たなピークが生じ、lucilactaene (1) のカルボン
酸部分が脱メチル化された代謝物であることが予想された (Fig. 1-3)。luc1 株を用いて培
養し、lucilactaene 脱メチル化体と推定される peak 3 を 2 mg 取得した (Fig. 1-4)。
Fig. 1-2 精製した lucilactaene (1) と NG-391 (2) の UPLC クロマトグラム
Fig. 1-3 野生型株とΔluc1 株の代謝物分析
8
Fig. 1-4 精製した peak 3 の UPLC クロマトグラム
9
1-3.Peak 3 の構造決定
Peak 3 は高分解能エレクトロスプレーイオン化飛行時間型ＭＳ（HRMS）を用いて分子
式が C21H25NO6 であると決定された（実測値 m/z: 386.1599 [M-H]-、C21H25NO6 について
計算値 386.1609）
。Peak 3 の物理化学的性質を Table 1-1 にまとめた。次に、NMR 解析に
より化学構造を決定した (Fig. 1-5～9)。その結果、peak 3 が demethyllucilactaene と（8
Ｚ）demethyllucilactaene との混合物であることが明らかになった (Fig. 1-10）。これら 2
つの構造は 1H-1H COSY によって区別された（Table 1-2）
。
（8Ｚ）demethyllucilactaene
は、C8 および C9 のプロトンカップリング定数が 11 であるため、シス型であることが明ら
かとなった。また、lucilactaene (1) とケミカルシフトを比較したところ、２つのシグナル
を除いて demethyllucilactaene (3, 4)のケミカルシフトは lucilactaene (1) のものと一致し
た。Demethyllucilactaene (3, 4) においては C21 位のシグナルは観察されず、C 20 位のケ
ミカルシフト値はより低い値に変化していた。
以上の結果から、luc1 株が demethyllucilactaene を蓄積していることが示され、Luc1
が demethyllucilactaene (3, 4)のカルボキシル基をメチル化する酵素であることが明らか
になった。このメチル化は、fusarin C（Fig. 1-1）生合成の最終工程と対応する 11。Fusarin
C の場合、メチル基転移酵素 (Fus9) は、カルボキシル基のメチル化を担う。我々のデータ
は Luc1 が Fus9 のオルソログであることを示している。
10
Appearance
Pale yellow amorphous solid
Molecular formula
C21H25NO6
HRESITOFMS (m/z)
found: 386.1599 [M-H]-, calc’d for C21H24NO6: 386.1609
UVλmax nm (ε in MeOH)
282 (9400), 362 (28600)
IR(ATR) ν(cm-1)
3234, 1700, 16437 1569, 1384, 1363, 1238, 1052, 995
Table1-1 Peak 3 の物理化学的性質
11
Fig. 1-5 Peak 3 の 1H-NMR
Fig. 1-6 Peak 3 の 13C-NMR
12
0.61
0.24
0.45
0.94
1.52
1.11
1.22
1.05
0.93
0.40
0.59
1.00
2.83
2.97
1.05
1.06
0.48
0.90
0.47
0.41
abundance
1.0 2.0 3.0
0.94
0.45
0.24
0.61
2.0
2.83
1.52
3.0
1.11
6.0
5.0
4.0
1.05
1.22
0.59
0.40
0.93
1.00
1.05
Y : parts per Million : Proton
8.0
7.0
2.97
0.90
0.48
1.06
0.47
0.41
7.0
X : parts per Million : Proton
6.0
5.0
4.0
3.0
Fig. 1-7 Peak 3 の 1H-1H COSY
13
2.0
1.0
abundance
2.0
3.0
Fig. 1-8 Peak 3 の HSQC
Fig. 1-9 Peak 3 の HMBC
14
Table 1-2 Lucilactaene と peak 3 のケミカルシフトの比較
Fig. 1-10 Peak 3 の化学構造
15
1-4. Lucilactaene、NG-391、demethyllucilactaene の生物活性評価
Lucilactaene 微生物やほかのがん細胞種への活性や機能を解析するために、３化合物
の生物活性評価を依頼した。その結果、lucilactaene (1) と NG-391 (2) はがん細胞とマラ
リア原虫に対して増殖阻害活性が認められたが、抗菌 及び抗真菌活性は示さなかった
（Table 1-3）
。
一方、demethyllucilactaene (3, 4) では lucilactaene (1) が示していた活性が著しく低下
した。これらの結果より、lucilactaene (1) の活性にはエーテル環の形成とカルボキシル基
のメチル化が重要であることが明らかとなった。
Table. 1-3 Lucilactaene (1) 、NG-391 (2)、demethyllucilactaene (3, 4)の生物活性評価
16
1-5. 考察
本章では lucilactaene (1) の生理活性を調べるべく、lucilactaene (1) 、NG-391 (2) 、
demethyllucilactaene (3) を精製し生物活性を評価した。その結果、lucilactaene (1) と
NG-391 (2) は動物細胞とマラリア原虫に対して増殖阻害活性を示したのに対し、
demethyllucilactaene (3)は活性を示さなかった。これらの結果から、カルボキシル基のメ
チル化が活性に必要であることが示唆された。また、lucilactaene (1) は 0.056 µg/ml とい
う低濃度で抗マラリア活性示すのに対し、エーテル環の開環した NG-391 (2) では活性が
低くなることから、lucilactaene (1) のエーテル環がマラリア原虫に対する活性には重要
であることが示唆された。特筆すべき点として、全ての化合物はバクテリアや真菌に対し
て活性を示さなかった。また、fusarin C はカビ毒として知られている 17。Fusarin C のア
ナログである fusarin A（Fig. 1-1）は lucilactaene と類似した構造を持ち、変異原性を持
たないことが報告されている 18。Fusarin A は lucilactaene (1) と似た活性を持つことが
考えられる。
17
第 2 章タンパク質合成阻害剤 hygromycin B 処理による二次代謝産物生産誘導の解析
2-1. 背景と目的
真菌は栄養源や pH、温度などの外部環境の変化に対応して二次代謝産物を生合成す
ることが知られている 19。環境要因と転写因子の関係性は現在まで幅広く研究されてお
り、PacC と pH20、CCAAT-binding complex (CBC) と鉄イオン 21、AreA と窒素 22、
velvet 複合体と光 23、CreA と炭素源 24 が報告されている。これらの転写因子が二次代
謝の生合成遺伝子クラスターの発現を制御している。Aspergillus 属では更にシグナル
伝達経路について研究されている。外部刺激に応答する経路は Tor 経路、Ca2+経路、
cAMP 経路、HOG 経路が保存されていることが知られている 19。二次代謝産物生合成
遺伝子はグローバルな制御因子 LaeA によって制御されていることも報告されている
25, 26, 27。また、二次代謝産物生合成遺伝子はヒストンの修飾が変化することで、発現す
るようになり、二次代謝産物が生産されるようになる。例えば HDAC 阻害剤であるニ
コチンアミドの添加によりヒストンアセチル化を上昇させることにより、二次代謝産物
を誘導することができることが知られている 28, 29。しかし、これらを駆使したとしても
すべての二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの代謝産物が生産されるようになるわ
けではない。今でもなお、二次代謝産物の活性化手法は求められている。
本章ではタンパク質合成阻害剤である hygromycin B が二次代謝を活性化させるこ
とを見出している。lucilactaene 生産菌において hygromycin B 処理により生産誘導さ
れる二次代謝産物を同定し、生理活性を明らかにすることを目的とした。
18
2-2. ...
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