新規ムスカリンM3受容体ポジティブアロステリックモジュレーターASP8302による排尿障害治療薬への適用に関する研究
概要
新規ムスカリン M3 受容体
ポジティブアロステリックモジュレーター
ASP8302 による
排尿障害治療薬への適用に関する研究
2023 年 1 月
沖本りさ
新規ムスカリン M3 受容体
ポジティブアロステリックモジュレーター
ASP8302 による
排尿障害治療薬への適用に関する研究
筑波大学大学院
理工情報生命学術院
生命地球科学研究群
生命産業科学学位プログラム
博士(生物工学)学位論文
沖本りさ
目次
略語一覧・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ii
序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1
本論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9
第 1 章 新規ムスカリン M3 受容体ポジティブアロステリックモジュレーター(PAM)
ASP8302 のヒト M3 受容体発現細胞およびヒト膀胱組織を用いた評価・・・・・10
第一節 背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
第二節 実験項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・11
第三節 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・18
第四節 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・23
第 2 章 新規ムスカリン M3 受容体ポジティブアロステリックモジュレーター
ASP8302 のラット膀胱機能およびラット排尿障害モデルに対する評価・・・・・43
第一節 背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・43
第二節 実験項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・44
第三節 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・50
第四節 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・53
総括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・68
参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・73
謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・88
発表論文目録・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・89
i
略語一覧
Ach
Acetylcholine
Bmax
Maximum number of binding sites
BOO
Bladder outlet obstruction
CCh
Carbamoylcholine chloride
CHO
Chinese hamster ovary
CI
Confidence interval
CRC
Concentration-response curve
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DU
Detrusor underactivity
EC50
Effective concentration 50
ECL
Extracellular loop
ED
Erectile dysfunction
EFS
Electric field stimulation
ELRs
Ejaculation-like responses
Emax
Maximum efficacy
IC50
Half-maximal inhibitory concentration
i.d.
Intraduodenal
IVP
Intravesical pressure
mAChR
Muscarinic acetylcholine receptor
M3
Muscarinic M3
NMS
[3H] N-methylscopolamine
PAM
Positive allosteric modulator
PNS
Pelvic nerve stimulation
S.E.M.
Standard error of the mean
ii
TIP
Tracheal insufflation pressure
TM
Transmembrane
UAB
Underactive bladder
iii
序論
1
ムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)は、5 つのサブタイプを持つ G
タンパク質共役型受容体ファミリーであり、副交感神経終末から放出される
acetylcholine(ACh)の幅広い生理学的効果を仲介する(Fetscher et al., 2002; Wess et
al., 2003)。mAChR ファミリーでは、ムスカリン M3(M3)受容体が広く発現して
おり、平滑筋の収縮や腺からの分泌など、さまざまなコリン作動性機能を担ってい
る(Wess et al., 2007)。複数の受容体アゴニストとコリンエステラーゼ阻害剤が M3
受容体の不十分な活性化によって引き起こされる疾患の治療に使用されてきたが、
現在利用可能なアゴニストは受容体サブタイプの選択性が低く、過剰な活性化に
より有害なコリン様副作用を引き起こすなどのリスクを伴う(Pakala et al., 2022)。
ポジティブアロステリックモジュレーター(PAM)は、オルソステリックリガン
ド結合部位とは空間的に異なるアロステリックリガンド結合部位に結合し、オル
ソステリックリガンド結合部位にリガンドが結合し受容体が活性化することに
よって媒介される反応を増強する(Fig. 1)。一部の PAM は、受容体に対するアゴ
ニストの結合親和性を高めるが、その他の PAM は、主に受容体の構造変化によっ
て、オルソステリックアゴニストの有効性のみを高めるか、親和性と有効性の両方
を高める(Conn et al., 2009)。アゴニストと比較して PAM は、アゴニストによる受
容体活性化時の反応のみを高めることによって副作用を回避し、mAChR の 5 つの
サブタイプ間で高度に保存されているオルソステリック部位を標的としないこと
によってサブタイプの選択性を得るのに有利であると考えられている(Dror et al.,
2013; Kruse et al., 2013)。
過去数十年の研究を通じて mAChR サブタイプのアロステリック調節のメカニ
ズムの理解とアロステリックリガンドの同定が著しく進んだ(Burger et al., 2018)。
mAChR 変異体を使用した過去の研究では、mAChR のアロステリックリガンドが
細胞外ループ(ECL)および膜貫通(TM)ヘリックスの上部の領域に結合するこ
とが示唆されている(Gnagey et al., 1999; Krejcί and Tucek, 2001; Huang et al., 2005)。
2
ヒト M2 受容体の分子構造とアロステリックモジュレーターとの相互作用の決定に
よって、アロステリックリガンドの結合と作用のための重要な残基とアミノ酸
(Gregory et al., 2007)が 2 番目と 3 番目の ECL と 2 番目と 7 番目の TM 領域であ
ることが報告されている(Haga et al., 2012; Dror et al., 2013; Kruse et al., 2013)。ま
た、ラット M3 受容体の構造も報告されている(Kruse et al., 2013)。しかしながら
M3 受容体のアロステリック部位とアロステリックリガンドの作用機序に関する詳
細は、おそらく利用可能なツールの親和性が低く、選択性が限られているため、完
全には解明されていない(Bock et al., 2018)。現在まで、ハイスループットスクリー
ニングと包括的な構造活性相関研究を通じて M3 優位に活性を示す PAM の同定や
創製を報告している研究はごくわずかである(Tanaka et al., 2020, 2021)。
下部尿路の主な役割は、膀胱と尿道による協調作用を通じて尿を蓄え、排尿する
ことである。膀胱は尿を適切に貯蔵および排出するために重要であるため、その機
能不全は、世界中の多くの人々の生活の質に影響を与えるさまざまな排尿障害に
直接関係している(Fowler et al., 2008)。膀胱排出障害は、膀胱が適切に収縮できな
い場合、および/または排尿筋の収縮性と出口抵抗との間に不均衡がある場合に発
生し、残尿の増加、排尿効率の低下等を引き起こす。この排尿時膀胱収縮力を低下
させる要因としては加齢、前立腺肥大、神経疾患、脊髄損傷、骨盤内手術による神
経障害などが知られている。様々な疾患背景により,膀胱収縮力の低下と尿道弛緩
不全が起こり,結果として尿道抵抗が膀胱収縮圧を上回ることで,排尿障害が起こ
ると考えられている(Fig. 3)。排尿筋活動低下(DU)と呼ばれる排尿中の膀胱収
縮力の尿力学的に定義された現象に加えて(Osman et al., 2014; van Koeveringe et al.,
2011)、DU に関連する臨床状態は低活動膀胱(UAB)と呼ばれる(Chapple et al.,
2018)。低活動膀胱の定義は調査ごとに異なり、尿流動態評価を受けている患者に
限定されているため、疫学に関する正確なデータは現段階では存在しない。UAB
患者は残尿感、失禁または頻尿を主訴として来院する。残尿量を指標として、超音
3
波等で診断する。50~150 mL の残尿量を呈する患者層が現行薬物治療の対象患者
と考えられている(van Till et al., 2022)。
現行薬物治療としては膀胱 M3 受容体を標的とする薬物療法が広く行われてい
る。M3 受容体はコリン作動性膀胱平滑筋収縮を調節する上で重要な役割を担うた
め、排尿障害の治療に用いられる(Sellers et al., 2012)。しかし、DU または UAB の
治療で用いられる distigmine bromide(以下、distigmine)や bethanechol chloride 等
の M3 受容体を活性化する現在利用可能な薬剤には、過剰な受容体活性化によりコ
リン作動性副作用を引き起こす重大なリスク(Pakala et al., 2022)があり、そのリ
スクにより十分な臨床効果が得られず、特定の患者層への適用に限られている
(Barendrecht et al., 2007)。M3 受容体の PAM は、標的受容体の間接的な活性化と
アロステリック部位の標的化によるより高いサブタイプ選択性(Dror et al., 2013;
Kruse et al., 2013)によって理論的には DU または UAB の既存の直接コリン作動薬
よりも副作用が少なくより良い効果を達成できる可能性があり、その結果より広
い患者層に使用されることが期待される。
以上の背景をもとに、アステラス製薬株式会社では M3 受容体 PAM の創製を目
指して研究を開始し、M3 受容体発現細胞を用いた PAM 活性試験、ラット摘出膀胱
収縮増強作用試験、ラット骨盤神経刺激膀胱内圧上昇増強作用試験およびラット
排尿障害モデルといった様々なスクリーニング試験および構造活性相関研究、最
適化研究を実施した結果、アステラス製薬貯蔵の数千個のスクリーニング化合物
の中から、M3 受容体に対して強い PAM 活性を有し排尿機能を改善させる可能性
を持つ化合物として ASP8302(Fig. 2)を見出した(Takahashi et al., 2015; Okimoto
et al., 2021, 2022)。
本研究では,新規 M3 受容体 PAM ASP8302 による排尿障害治療薬への適用に関して
検討した。
第一章では、ASP8302 のヒトムスカリン受容体に対する PAM 活性、M3 受容体
4
に対する受容体結合能、M3 キメラ受容体および変異受容体を用いた受容体活性化
の増強に必要な M3 受容体のアミノ酸配列の主要部位特定、加えてヒト摘出膀胱収
縮に対する増強作用試験を実施し、ASP8302 の M3 受容体アロステリック調節のメ
カニズムならびに M3 受容体の代表的な生物学的機能である膀胱機能に対する効果
を検討した。第二章では、ASP8302 のラットにおけるムスカリン受容体 PAM 活性、
摘出膀胱収縮および麻酔下骨盤神経刺激誘発膀胱内圧上昇に対する増強作用を検
討し、さらに ASP8302 およびコリンエステラーゼ阻害剤 distigmine のラット薬物
誘発排尿障害モデルおよびラット尿道部分閉塞モデルにおける排尿障害に対する
作用の比較を通じて、排尿時膀胱収縮力低下に対する作用およびその臨床病態外
挿性について考察した。また、ASP8302 の排便および呼吸に対する作用を評価し、
副作用との乖離の観点で ASP8302 の排尿障害治療薬としての有用性を検討した。
5
A.
B.
Figure 1. Concept of positive allosteric modulator.
(A) PAMs bind to a topographically distinct site (allosteric site) from orthosteric site on a receptor
to modulate agonist affinity and/or efficacy. (B) Effect of PAM on the concentration-response
relationship of an orthosteric agonist mediated by PAM. PAM enhances orthosteric agonist affinity
(red) and/or efficacy (blue).
PAM, positive allosteric modulator.
6
Figure 2. Chemical structure of ASP8302 (3-[(2S)-4-(5-{[4-(4-chlorothiophen-2-yl)-5-{[(2R)-2methylpyrrolidin-1-yl]methyl}-1,3-thiazol-2-yl]carbamoyl}pyrazin-2-yl)-2-methylpiperazin1-yl]propanoic acid).
7
Figure 3. Pathophysiology of bladder emptying disorders.
Various disease backgrounds cause decreased bladder contractility and urethral dysfunction such as
increased urethral resistance, resulting in urinary disorders.
8
本論
9
第 1 章
新規ムスカリン M3 受容体ポジティブアロステリックモジュレーター
(PAM)ASP8302 のヒト M3 受容体発現細胞およびヒト膀胱組織を用いた評価
第一節 背景
M3 受容体は、内臓平滑筋収縮や腺分泌など、ACh によって誘発されるさまざま
な機能を仲介する。PAM は、時空間受容体活性化制御と潜在的に優れたサブタイ
プ選択性により、ムスカリン作動薬によるさまざまな副作用を回避することがで
きると考えられる。しかし、おそらく強力で選択的な PAM が今まで存在しなかっ
たため、M3 受容体のアロステリック調節のメカニズムは完全には理解されていな
い。
本章では、M3 受容体の新規 PAM である ASP8302 のヒトムスカリン受容体発現
細胞およびヒト膀胱組織に対する活性作用を調べ、ASP8302 が M3 受容体 PAM と
して作用することを確認すると共に、ASP8302 が不十分な M3 受容体活性化によっ
て引き起こされる疾患に対する治療薬として有用である可能性を検討した。また、
ヒト M3 受容体変異体(M1 受容体および M3 受容体の複合受容体)を作製し、受容
体活性化の増強に必要な M3 受容体のアミノ酸配列の主要部位を調査し、M3 受容
体のアロステリック調節のメカニズムを検討した。
10
第二節 実験項
1) 被験化合物
ASP8302(Fig. 2)はアステラス製薬株式会社により合成された。受容体結合試験
およびヒト M3 受容体以外のムスカリン受容体発現細胞を用いた細胞内 Ca2+流動
測定には ASP8302 dihydrochloride を使用した。ヒト M3 受容体の細胞内 Ca2+流動測
定およびヒト摘出膀胱収縮実験には ASP8302 dimaleate を使用した。
ASP8302 は DMSO に溶解して in vitro 実験に使用した。Carbamoylcholine chloride
(CCh)
(Sigma-Aldrich、St. Louis, Missouri)、atropine sulfate salt monohydrate(和光
純薬工業株式会社)、および acetylcholine chloride(Sigma-Aldrich)は水に溶解した。
受容体結合試験で用いた[N- Methyl -3H] scopolamine([3H] NMS)は PerkinElmer Inc.
(Boston, Massachusetts)から購入し、反応バッファー[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5),
10 mmol/L MgCl2, and 1 mmol/L EDTA for binding studies]に溶解した。
2) ヒトムスカリン M1、M2、M3、M4 および M5 受容体とヒト M3 受容体変異体発現
細胞の構築と培養
ヒトムスカリン受容体発現 CHO-K1 細胞はアステラス製薬株式会社で構築され
た。Table 1 に示したプライマーを使用してヒトゲノム DNA から増幅されたヒト
M1、M2、M3、M4 および M5 ムスカリン受容体のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産
物 を pcDNA3.1 ( Life Technologies Japan Ltd. 、 Tokyo 、 Japan ) に 挿 入 し た 。
LipofectAMINE 2000 試薬(Life Technologies Japan Ltd.)を使用して、発現ベクター
およびムスカリン受容体発現ベクターを CHO-K1 細胞(American Type Culture
Collection CCL-61)にトランスフェクトした。細胞を 2 mmol/L グルタミン酸、10%
ウシ胎児血清、2 mg/mL geneticin(Life Technologies Japan Ltd.)を含む α-minimum
essential medium(α-MEM)で約 4 週間培養し、各ムスカリン受容体を安定して発
11
現する薬剤耐性クローンを取得した。Gi/o タンパク質に結合している M2 および M4
ムスカリン受容体サブタイプのシグナル伝達経路を Gq シグナル伝達経路に変換
するために、ヒト M2 および M4 発現細胞にはヒト G15 G タンパク質 α サブユニッ
ト発現ベクターもトランスフェクトし、0.5 mg/mL hygromycin B の存在下で薬剤耐
性クローンを選択した。
変異ムスカリン受容体発現ベクターの構築に用いた手法,PCR 鋳型およびプラ
イマーの情報を Table 2 に示す。ヒト M3 受容体変異発現ベクターは、PCR ベース
の単一部位変異誘発またはインバース PCR ベースの部位特異的変異誘発によって
構築された。インバース PCR、Dpn I によるテンプレートプラスミドの消化および
PCR 産物のセルフライゲーション(キナーゼ/リガーゼ)は、KOD-Plus-Mutagenesis
Kit(Toyobo)を製造元の取扱説明書に従って使用した。M3_TM2_M1 および
M3_T4_M1 は、インバース PCR ベースの部位特異的突然変異誘発およびメガプラ
イマーポリメラーゼ連鎖反応によって構築された(Tyagi et al., 2004)。N 末端 M3
受容体配列を PCR により増幅し、アガロースゲル電気泳動により精製した(Table
2 に 1st PCR として示す)。この断片をメガプライマーとしてインバース PCR を
行った(Table 2 に 2nd PCR として示す)。インバース PCR、DpnI によるテンプレー
トプラスミドの消化、および PCR 産物のセルフライゲーション(キナーゼ/リガー
ゼ)は、メーカーの説明書に従って KOD -Plus- Mutagenesis Kit(Toyobo)を使用し
て実施した。M3_TM5_M1 および M1_TM5_M3 は、PCR ベースの単一部位変異誘
発によって構築された(Zeng et al., 2017)。M1 受容体および M3 受容体配列を PCR
で増幅し、アガロースゲル電気泳動で精製した(Table 2 に 1st PCR として示す)。
この断片を鋳型として 2nd PCR を行った。PCR 産物を EcoRI および BamHI で消化
し、アガロースゲル電気泳動で精製し、pcDNA3.1(-)EcoRI–BamHI 部位に挿入した。
M3_ECL2_M1 および M1_ECL2_M3 は、インバース PCR ベースの部位特異的突然
変異誘発によって構築された(Fisher et al., 1997)。インバース PCR(Table 2 に 1st
12
PCR として示す)、DpnI によるテンプレートプラスミドの消化、および PCR 産物
のセルフライゲーション(キナーゼ/リガーゼ)は、KOD -Plus- Mutagenesis Kit
(Toyobo)を使用して製造元の取扱説明書に従って実施した。変異体構築物の配列
は 、 DNA シ ー ク エ ン シ ン グ に よ っ て 確 認 し た 。 M1_TM4_M3 、
M3_TM4_M1_TM5_M3
M1_TM4_M3_TM5_M1
、
、
M3_ECL2_F210L_K213E_E228Q_T230I 、 M3_ECL2_F210A 、 M3_ECL2_K213A 、
M3_ECL2_E228A, M3_ECL2_T230A、M1_ECL2_I187T および M5_ECL2_T192A の
プラスミド DNA は遺伝子合成(Thermo Fisher Scientific)により構築された。ヒト
M1、M3 または M5 受容体発現細胞は、37℃、5% CO2 中で 10%ウシ胎児血清、50
U/mL penicillin、50 μg/mL streptomycin、2 mmol/L L-glutamine および 0.2 mg/mL
geneticin を添加した α-MEM で培養した。ヒト M2 または M4 受容体発現細胞は、
37℃、5% CO2 中で 10%ウシ胎児血清、50 U/mL penicillin、50 μg/mL streptomycin、
2 mmol/L L- glutamine、0.2 mg/mL geneticin および 50 μg/mL hygromycin を添加した
α-MEM で培養した。 ...