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次世代シーケンサーを用いた変異原暴露による変異の直接検出とヒトがんゲノム変異との関連解析

松村 奨士 Matsumura Shoji 名古屋市立大学

2021.01.29

概要

がんは、食品、飲料や環境中に存在する化学物質など、様々な変異原の暴露によって、細胞内のゲノム配列に生じる変異により引き起こされると考えられている 1,2)。従来のがんゲノム変異解析においては、分子生物学的手法により、がん遺伝子やがん抑制遺伝子な ど、がん細胞が有する増殖能の直接の原因となる変異を中心に、情報が蓄積されており3,4)、これらの知見が我々のがんゲノム変異の理解の基礎となっている。これらがん細胞中のゲノムに存在する変異の情報から、がんと変異原との関連性が推察されており 5)、がん細胞のゲノム変異を引き起こす様々な環境変異原とヒトがんとの因果関係を理解することは、ヒトがんの予防およびがんの原因となる化学物質の管理に重要と考えられる。

近年、次世代シーケンサー (Next generation sequencer, NGS) の技術が開発され、ゲノム変異解析においては、従来の特定の遺伝子に限定された解析から、全ゲノム領域に渡る大規模な解析が可能になった。例えば汎用されるイルミナ社の NGS は、一度に 600 Gbp 以上の DNA 配列データを得ることができ、ヒトゲノムの変異に関する網羅的なデータを得ることができる。ヒトがんゲノム研究の分野では、このNGS の技術を用いて、ゲノム変異 の大規模な解析が盛んに進められており 6)、がんの直接原因となる変異だけでなく、がんの増殖に対して中立な変異も含め、大規模なデータが得られるようになった 4,7)。ヒトがんゲノムの大規模な変異情報には、がん細胞が過去に暴露された変異原の情報が含まれていると考えられ、その情報を詳細に調べることで、各種ヒトがんとその原因となる変異原との関係について、より詳細な考察が可能になると期待される 8,9)。

特に近年、サンガー研究所を中心とした研究グループは、ヒトがんゲノムの大規模変異データから、数学的モデルを用いて、個々の変異原の暴露による変異パターンを分離抽出する方法を構築した 10,11)。ここで抽出された各変異パターンは変異シグネチャーと呼ば れ、対象のヒトがんがその発生過程において暴露された変異原による変異パターンであると考えられる 12)。Alexandrov らは、データが大規模であるという特性を活かし、6 種類の塩基対置換 (i.e. G:C > T:A、G:C > C:G、G:C > A:T、A:T > T:A、A:T > C:G、A:T > G:C)を、前後の塩基配列によってさらに 16 種類に分類し、96 次元のデータとして変異パターンを抽出した 13)。これにより、変異原ごとにそのメカニズムに応じた変異パターンを抽出することに成功し、既知の変異原暴露による変異に関する知見と比較することで、ヒトがんといくつかの変異原との関連を見出すことに成功している。今後、より多くのヒトがんゲノムより変異シグネチャーの抽出が進められ、変異原とヒトがんとの因果関係を見出すことができれば、ヒトがんの予防やがんの原因となる化学物質の管理に有用と考えられる。

ヒトがんゲノム解析に関する研究が進展する中で、そこで得られた知見を、原因となる変異原の同定に活用するためには、変異原暴露によって生じる変異との照らし合わせが必要である 14)。そのためには、変異原の暴露によってどのような変異が生じるか、その特徴の理解、情報の蓄積が不可欠である。原因として想定されうる変異原はがんごとに様々であり、複数の組み合わせであること、また細胞種により変異に違いがあることも想定されることから、正確な特徴の理解には多様な変異原の詳細な変異データを蓄積することが重要である。しかし、変異原暴露によって生じる変異に関する知見は限られており、ヒトがんゲノム解析から得られた変異シグネチャーとの対比が可能な詳細な変異データは取得できておらず、これらのデータ蓄積が課題となっている。

従来、変異原暴露による変異の検出には、in vitro や in vivo のモデルを用いた変異原性試験が用いられてきた。代表的なものに、in vitro モデルでは、サルモネラ菌を用いたAmes試験があり、in vivo モデルでは、gpt delta マウスなどの、指標遺伝子を導入したトランスジェニック (Transgenic, TG) 動物を用いるモデルが用いられている 15,16)。Ames 試験ではヒスチジン生合成遺伝子に変異を有するサルモネラ菌変異株を使用し、変異原暴露による変異を制限培地上でのコロニー数により検出する。従来の変異原暴露による変異の知見は、基本的にこれら評価モデルの試験結果に基づいており、実際誘発された変異に関する直接のデータではない。これらのモデルにおいては、指標遺伝子のDNA 配列を調べることで、生じた塩基対置換の比等のデータも取得できるが、指標遺伝子という限られた範囲での解析のため、検出可能な変異数は高々100 個と非常に限られる。従って、従来の変異原性の評価モデルに基づいて、がんゲノム研究で得られた結果と対比可能なデータを得ることは極めて困難であり、変異原暴露によりゲノム全体に生じる変異の情報を取得する新たな手法の開発が必要であるそこでヒトがんゲノム研究と同様に、変異原暴露による変異の大規模なデータ取得を実現するため、変異検出にNGS を活用することが期待されている 17)。しかし、NGS を活用する際の最大の課題は、変異原暴露により個々の細胞にランダムに生じる低頻度な変異 を、どのように検出するかである。NGS は散発的なシーケンスエラーを含むため、細胞集団内に一定の頻度で共通して存在する変異でなければ、正確な検出は困難である。そのため従来、NGS による解析事例では、変異原暴露後に単一細胞を単離する、または動物に腫瘍を形成させることにより、集団を均質化するアプローチが取られてきた。このアプローチにより、サルモネラ菌 18,19)、哺乳類細胞 20,21)、さらに動物 22) を用いて、NGS による変異検出が可能であることが示されている。しかし、これらの方法は集団の均質化の操作に由来する変異のバイアスが否定できないことや、実験効率が非常に悪く、また単離培養の難しい哺乳類細胞等には適用が困難である点が問題として挙げられ、多様な変異原のデータ収集には適していない。細胞の単離を複数回繰り返すことも考えられうるが、実験の手間やコストを考えると現実的ではなく、より効率的に変異情報を取得する方法の確立が必要である。

そこで本研究では、細胞の単離を介さず、変異原を暴露した集団をNGS で直接解析する方法を構築することとした。より具体的には、NGS で得られる個々の断片の配列情報は、集団内の単一細胞に由来するDNA 配列情報であることから、これに基づき変異を検出し、集団全体の変異情報を一度に得る解析法の構築を目指した (Fig. 1)。本アプローチ では、NGS のエラーと真の変異との区別が困難であり、個々の変異の正確な検出は難しい可能性が考えられる。その一方で、細胞集団におけるゲノム全体の変異の傾向に関する情報を、より簡便に取得できる可能性が考えられる。その実現可否は主にシーケンスエラーの頻度と変異原暴露による変異の頻度との関係に依存すると考えられるが、現状、変異原がもたらす変異の頻度に関しては情報が少なく、検証されていない。そこで第二章では、まず同アプローチによる解析法を構築し、変異頻度が既知の DNA サンプルを用いて、変異検出の実現可否と検出感度の確認を行った。さらにAmes 試験に汎用される Salmonella typhimurium (S. typhimurium) LT-2 TA100 株を用い、変異原暴露による変異頻度の関連から、変異解析の実現可能性を確認した。その後第三章では、必要となる感度の達成のため、高精度なシーケンス法の構築を行い、様々な代表的変異原の評価へ適用を進め、その有用性を考察した。最後に第四章では、第三章で得られた変異情報をもとに、96 次元の変異パターンを算出し、変異メカニズムおよびヒトがんの変異シグネチャーとの類似性を確認し た。本研究により確立された変異解析手法は、様々な変異原の暴露による変異情報を簡便に取得することを可能とし、ヒトがんの原因変異原の同定や、化学物質等の変異原の発がんへの寄与の理解に極めて有用であると期待できる。

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参考文献

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