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書き出し

チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索

江木, 雄一 神戸大学

2023.03.25

概要

Kobe University Repository : Kernel
PDF issue: 2024-05-02

チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索

江木, 雄一
(Degree)
博士(農学)

(Date of Degree)
2023-03-25

(Date of Publication)
2024-03-01

(Resource Type)
doctoral thesis

(Report Number)
甲第8661号

(URL)
https://hdl.handle.net/20.500.14094/0100482409
※ 当コンテンツは神戸大学の学術成果です。無断複製・不正使用等を禁じます。著作権法で認められている範囲内で、適切にご利用ください。

別紙様式 3 (博士論文審査等内規第 2条関係)

博士論文内容の要旨



名江木雄一

専攻・講座

生命機能科学専攻・農環境生物学講座

論文題目(外国語の場合は,その和訳を併記すること。)

チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索

指導教員

坂本克彦

(氏名:江木雄一

N0.l)

概要
カイコの卵休眠は母性制御されており、二化性系統では、母親が卵期と幼虫期に受容し
た環境情報をもとに次世代卵の休眠モード(休眠・非休眠)が決定される。休眠モードの
プログラミングは幼虫の脳で行われ、作成されたプログラムは脳に保存されることが明ら
かにされている。しかし、環境情報をもとに休眠モードをプログラミングするメカニズム
については、分子レベルで明らかにされていない。本研究では、網羅的な遺伝子発現解析
技術である DNAマイクロアレイ解析と CAGE解析を用いた遺伝子スクリーニングによって、
カイコの休眠プログラミングに関与する遺伝子を同定した。
第 1章 序 論
カイコは、冬を越すために、卵(胚)で休眠する。カイコの卵休眠は母性制御されてお
り、二化性系統では、母親が卵期と幼虫期に受容した環境情報をもとに次世代卵の休眠モ
ード(休眠・非休眠)が決定される。休眠モードは蛹期よりも前に決定され、蛹期ではそ
れにしたがって内分泌系が調節されて、産下する卵の休眠化または非休眠化が起こる。こ
の休眠モードのプログラミングは母親の幼虫の脳で行われ、作成されたプログラムは脳に
保存される。しかし、環境情報をもとに休眠モードをプログラミングするメカニズムにつ
いては、分子レベルで明らかにされていない。そこで本研究では、網羅的な遺伝子発現解
析技術である DNAマイクロアレイ解析と CAGE解析を用いて、カイコの休眠制御に関連す
る遺伝子の検索を試みた。本研究では、「休眠制御関連遺伝子は休眠卵産下群(休眠群)と
非休眠卵産下群(非休眠群)の間で発現差異を示す」という仮説を立て、休眠群と非休眠
群の間で幼虫脳内の発現差異遺伝子をスクリーニングした。そして、得られた候補遺伝子
に対して RNAiによる機能解析を行い、休眠制御に本質的に関与しているかどうかを検証し


第 2章休眠制御可能なカイコ系統の選別
適当な休眠誘導刺激を与えることにより次世代卵の休眠率を 100%(休眠)または 0%(

休眠)に調節することができる、休眠制御関連遺伝子のスクリーニングに適した系統を選
別した。二化性と考えられている 1
0系統 (
c
l
O、g32、k06、n25、p21、p22、p24、p44
、p50、
および p63) を対象として、休眠誘導刺激である卵期の温度、卵期の明るさ、幼虫期の日長
のうち、いずれか 1つだけを調節し、他の条件は一定として休眠応答性を調べた。次世代
卵の休眠率を 100%または 0%にすることができた系統は、卵期の温度だけを調節した場合
は clO、p22、および p50で、卵期の明るさだけを調節した場合は p50系統のみであった。
また、幼虫期の日長だけを調節した場合は、 p44と p50系統であった。以上の結果から、 3
種類の休眠誘導刺激のいずれに対しても、そのうちの 1つだけを調節することで次世代卵
の休眠率を 100%または 0%に制御可能な系統は p50だけであった。したがって、本研究で

(氏名:江木雄一

N0.2)

は p50系統を研究対象とした。

第 3章

DNAマイクロアレイ解析を用いたカイコの休眠制御関連遺伝子の検索

DNAマイクロアレイ解析を用いて休眠制御関連遺伝子を検索した。休眠誘導刺激として、

卵期の明るさまたは卵期の温度を調節した 2つの実験グループを用意した。そして、各実
験グル
ープにおいて、休眠群と非休眠の間で発現差異を示す遺伝子をスクリーニングした。次に、
第 4章

CAGE解析を用いたカイコの休眠制御関連遺伝子の検索

CAGE解析を用いて休眠制御関連遺伝子を検索した。休眠誘導刺激として、卵期の明る

さ、卵期の温度、または幼虫期の日長を調節した 3つの実験グループを用意した。そして、
各実験グループにおいて、休眠群と非休眠の間で発現差 異を示す遺伝子をスクリーニング
した。次に、 3つの実験グループから得られた発現差異遺伝子のうち、 全ての実験グルー
プに共通するものを絞り込み、リアルタイム定量 PCRで mRNAの発現パターンを検証した。
その結果、休眠制御関連遺伝子の候補として、 J
u
v
e
n
i
l
ehormonea
c
i
dm
e
t
h
y
l
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
e(
J
h
a
m
t
)、

K
r
u
p
p
e
lh
o
m
o
l
o
g1 (
K
r
h
l
)、P
r
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t
o
n
c
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p
l
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df
o
l
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t
et
r
a
n
s
p
o
r
t
e
r (
P
c
f
t
)、および機能が未知な
U
n
c
h
a
r
a
c
t
e
r
i
z
e
dLOC110385080 (
L
O
C
8
0
) の 4つが得られた。いずれの遺伝子も、休眠群
で非休眠群よりも発現が多かった。そこで、これらの遺伝子に対して RNAiを用いた発現抑
制を行い、次世代卵の休眠率へ与える影響を評価した。その結果、 J
hamtまたは P
c
f
tのいず
れかをノックダウンした場合は休眠率が低下したが、 K
r
h
lまたは LOC-80のノックダウン
は休眠率に影響を与えなかった。これらのことから、 J
hamtおよび P
c
f
tがカイコの休眠プ
ログラミングに関与していることが示唆された。 J
hamtは JH合成の律速酵素をコードして
おり、 P
c
f
tは哺乳類の腸管の物質輸送系において食物から得られる葉酸を取り込む葉酸輸送
体をコードしている遺伝子である。したがって、 JHシグナル伝達系と葉酸がカイコの休眠
プログラミングに関与していると考えられる。

第 5章 総 合 考 察
本研究では、網羅的な遺伝子発現解析技術である DNAマイクロアレイ解析と CAGE解析を
用いて、カイコの休眠制御に関連する遺伝子の検索を試みた。その結果、 J
hamtと P
c
f
tが

カイコの休眠プログラミングに関与していることが示唆された。いずれも休眠群で非休眠
群よりも発現が多いことから、幼虫の脳でこれらの遺伝 子の発現が増加することが、休眠
を誘導する情報になっていると考えられる。さらに、 JHシグナル伝達系と葉酸が関与して
いる可能性も示された。 JHについては、様々な昆虫種において休眠制御に関係することが
示唆されてきた。しかし、葉酸については、休眠制御と の関連を示唆した報告が過去に数
件あるものの、近年は注目されていなかった。本研究の 成果は、休眠制御機構を分子レベ

(氏名:江木雄一

N0.3)

ルで解明するための新たな切り口になると考えられる。今後は、 JhamtとP
c
f
tの発現を制御
するメカニズムや、他の昆虫で休眠制御に関係すると考えられているインスリンシグナル
伝達系などとの相互作用を調べていく必要がある。

(別紙 1)

論文審査の結果の要旨

江木雄一

氏名
論文
題目

チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索
区分

職名



主査

教授

坂本克彦



副査

教授

前藤薫




副査

教授

森直樹

副査





副査






概要
昆虫は、冬のような生長に不適切な季節をやり過ごすために、成長や生殖を停止して、極端に
代謝を抑えた生理状態に入る。こうした仕組みは休眠と呼ばれ、体の小さい変温動物である昆虫
にとって、過酷な環境を生き抜くために不可欠な機能となっている。昆虫は多くの場合、日長や
気温などの環境情報を受容して季節変化予測し、将来とるべき休眠モード(休眠の ON または
OFF) を事前に決定する。これまで、様々な昆虫種を用いて、休眠に関する研究が多而的に行わ
れてきた。しかし、環境情報に基づいて将来的な休眠状態を決定する機構については、分子レベ
ルでの解明がほとんど進んでいない。そこで本研究では、母性制御された卵休眠を示すカイコを
研究対象として、休眠のプログラミングに関与する遺伝子の同定を試みた。具体的には、環境刺
激に対する休眠応答性の高いカイコ系統を選別して、休眠群と非休眠群を作成し、網羅的な遺伝
子発現解析技術である DNAマイクロアレイ解析または CAGE解析を用いたディファレンシャル
スクリーニングを行なった。さらに、絞り込まれた候補遺伝子に対して RNAiによる機能解析を
行い、目的遺伝子を同定した。これらの結果について、総合的な考察が行われている。
第 1章では、本研究の背景と目的および進め方が述べられている。
カイコは母性制御された卵(胚)休眠を示す。二化性系統では、母親が卵期と幼虫期に受容し
た日長や気温などの環境情報をもとに、次世代卵の休眠モード(休眠か非休眠)が決定される。
この決定に従って、母親の蛹期に内分泌系が調整され、産下する卵の休眠化もしくは非休眠化が
起こる。卵の休眠モードの決定(プログラミング)は母親の脳で行われ、作られたプログラムは
脳に保存される。しかし、環境情報をもとに休眠モードをプログラミングする機構については、
分子レベルでの解明が進んでいない。そこで本研究では、休眠のプログラミングに関与する遺伝
子の同定を目的とした。 「休眠制御関連遺伝子は、休眠卵産下群(休眠群)と非休眠卵産下群(非
休眠群)の間で発現差異を示す」という仮説を立て、休眠群と非休眠群の幼虫脳で発現する遺伝
子に対して、 DNAマイクロアレイ解析または CAGE解析を用いたディファレンシャルスクリー
ニングを行なった。さらに、異なる休眠誘導刺激を用いた複数の実験グループにおいて休眠群と
非休眠群を作成して、グループ間のデータを比較することにより、候補遺伝子の絞り込みを効率
的に行なった。得られた候補遺伝子に対して、 RNAi による機能解析を行い、休眠プログラミン
グヘの関与を検証している。
第 2章では、環境刺激による厳密な休眠制御が可能なカイコ系統を選別している。

母親の卵期または幼虫期に適当な休眠誘導刺激を与えことにより、次世代卵の休眠率を 100%(
眠)または 0% (非休眠)に制御することができる系統を選別した。こうした系統を用いることで、
休眠制御関連遺伝子のスクリーニングに適した実験グループを作成することが可能になると考え
0系統 (
c
l
O、g32、k06、n25、p21、p22、p24、p44、p50、および p63) を対象
た。二化性の 1

氏名

l

江木雄一

として、休眠誘導刺激である卵期の温度、卵期の明るさ、幼虫期の日長のうち、いずれか 1つだけ
を調節し、産下する卵の休眠応答性を調べた。その結果、次世代卵の休眠率を 100%または 0%に
制御することができた系統は、卵期の温度だけを調節した場合は clO、p22、および p50で、卵期
の明るさだけを調節した場合は p50のみであった。そして、幼虫期の日長だけを調節した場合は、
p44と p50であった。 3種類の休眠誘導刺激のいずれに対しても、 1つだけを調節することで次世
代卵の休眠率を 100%または 0%に制御できる系統は p50だけであった。そこで、 p50系統を本研
究の研究対象とすることになった。
第 3章では、 DNAマイクロアレイ解析を用いた休眠制御関連遺伝子の検索を行なっている。
休眠誘導刺激として、卵期の明るさ、または、卵期の温度を調節した 2つの実験グループを用意
した。そして、各グループにおいて休眠群と非休眠群の間で発現差異を示す遺伝子を、 DNAマイ
クロアレイ解析によってスクリーニングし、さらに、 2つの実験グループに共通する発現差異遺伝
子を絞り込んだ。その結果、 CytochromeP450lBal (CyplBal) および K
r
i
i
p
p
e
lhomolog1
(KrカI
) の 2つが得られた。いずれの遺伝子も休眠群において非休眠群よりも発現量が多かった。
この結果は、リアルタイム定量 PCRでも確認された。 CyplBalは、脱皮ホルモン(エクジステロ
イド)を不活性化させる酵素をコードしており、一方、 Kr-hlは幼若ホルモン (JH) のシグナル
伝達系の初期応答遺伝子であった。エクダイソンレベルの低下、および JHシグナル伝達系の活性
化が、カイコの休眠プログラミングに関与している可能性が示唆されている。
第 4章では、 CAGE解析を用いた休眠制御関連遺伝子の検索を行なっている。
休眠誘導刺激として、卵期の明るさ、卵期の温度、もしくは、幼虫期の日長を調節した 3つの実
験グループを用意し、各グループにおいて休眠群と非休眠群の間で発現差異を示す遺伝子を、高感
度の次世代シーケンスを利用した CAGE解析によってスクリーニングした。さらに、 3つの実験
グループから得られた発現差異遺伝子の中から、すべてのグループに共通するものを絞り込み、リ
アルタイム定量 PCRで mRNAの発現パターンを検証した。その結果、候補遺伝子として、 J
u
v
e
n
i
l
e
r
i
i
p
p
e
lhomolog1(Krカ1
)、Proton-coupledf
o
l
a
t
e
hormoneacidm
e
t
h
y
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t
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s
f
e
r
a
s
e(Jhamt)、K
t
r
a
n
s
p
o
r
t
e
r(
P
c
f
t
) 、および機能が未知な UncharacterizedLOC110385080 (LOC-80) の 4つ
が得られた。いずれの遺伝子も、休眠群において非休眠群よりも発現量が多かった。次に、幼虫期
の母親において、これらの遺伝子に対する RNAiを用いた発現抑制を行い、次世代卵の休眠モード
に与える影響を評価した。すると、 Jhamtまたは P
c
f
tをノックダウンした場合は、休眠率が有意
に低下した。しかし、 Kr力1または LOG-BOのノックダウンでは、休眠率への影響は観察されなか
c
f
tがカイコの休眠プログラミングに関与していること
った。これらのことから、 Jhamtおよび P
が示唆された。 Jhamtは JHの合成律速酵素をコードする遺伝子で、 P
c
f
tは哺乳類の腸管の物質輸
送系において葉酸を取り込む葉酸輸送体をコードする遺伝子である。母親の幼虫期において、 JH
シグナル伝達系が活性化され、葉酸の取り込みが促進されることが、次世代卵の休眠化を誘導する
情報となっている可能性が示されている。
第 5章では、以上の結果をもとに、カイコの休眠プログラミングの分子メカニズムについて、他種
の昆虫との比較を行いながら、総合的な考察が行われている。
本研究では、カイコの休眠のプログラミングに関与する 2つの遺伝子 Jhamtと P
c
f
tを同定し、休
眠制御への JHシグナル伝達系と葉酸の関与を示唆している。特に葉酸については、昆虫の休眠研究
においてこれまで注目されていなかった因子であり、新規性の高い発見となった。本研究の成果は、
昆虫の休眠制御機構を分子レベルで解明するための新たな切り口を提供する価値ある業績である。
よって、学位申請者の江木雄ーは、博士(農学)の学位を得る資格があると認める。

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参考文献

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