論文の公開元へチョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索
概要
Kobe University Repository : Kernel
PDF issue: 2024-05-09
チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索
江木, 雄一
(Degree)
博士（農学）
(Date of Degree)
2023-03-25
(Date of Publication)
2024-03-01
(Resource Type)
doctoral thesis
(Report Number)
甲第8661号
(URL)
https://hdl.handle.net/20.500.14094/0100482409
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博士論文
チョウ目昆虫カイコの休眠制御関連遺伝子の探索
2023 年 1 月
神戸大学大学院
生命機能科学専攻
農学研究科
農環境生物学講座
昆虫分子機能科学研究室
171A551A
江木雄一
本稿に含まれる出版論文の目録
第２章は次の論文からなる。
Egi Y., Akitomo S., Fujii T., Banno Y. and Sakamoto K. (2014) Silkworm strains that can be
clearly destined towards either embryonic diapause or direct development by adjusting a
single ambient parameter during the preceding generation. Entomological Science, 17, 396399.
第３章は次の論文からなる。
Akitomo S.*, Egi Y.*, Nakamura Y., Suetsugu Y., Oishi K. and Sakamoto K. (2017)
Genome-wide microarray screening for Bombyx mori genes related to transmitting the
determination outcome of whether to produce diapause or nondiapause eggs. Insect Science,
24, 187-193. *Equal contribution.
第４章は次の論文からなる。
Egi Y. and Sakamoto K. (2022) Genome-wide screening of genes involved in programming
diapause in the next generation in silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae).
European Journal of Entomology, 119, 405-412.
i
目次
第１章
序論 ......................................................................................................................... 1
第２章
休眠制御可能なカイコ系統の選別 ................................................................... 11
背景....................................................................................................................... 11
材料と方法........................................................................................................... 12
結果....................................................................................................................... 13
考察....................................................................................................................... 19
第３章
DNA マイクロアレイ解析を用いたカイコの休眠制御関連遺伝子の検索 . 22
背景 ....................................................................................................................... 22
材料と方法 ........................................................................................................... 24
結果 ....................................................................................................................... 28
考察 ....................................................................................................................... 34
第４章
CAGE 解析を用いたカイコの休眠制御関連遺伝子の検索 ........................... 37
背景 ....................................................................................................................... 37
材料と方法 ........................................................................................................... 39
結果 ....................................................................................................................... 43
考察 ....................................................................................................................... 55
図表（補足） ....................................................................................................... 58
第５章
総合考察 ............................................................................................................... 68
要旨 ....................................................................................................................................... 75
謝辞 ....................................................................................................................................... 79
参考文献 ............................................................................................................................... 80
ii
第１章
序論
昆虫の休眠について
昆虫の多くは、高温や乾燥、低温等にさらされる成長に不適切な季節を、休眠と
いう代謝を極端に抑えた生理状態でやり過ごす。生存に不利な季節の到来を予測し
て、事前に能動的に発育を停止させることが休眠の特徴である。昆虫は休眠に入る
と、エネルギー蓄積関連の代謝系や、老化や環境ストレスへの防御機能を活性化さ
せることで苛酷な環境に対する耐性を向上させ、厳しい季節が続く間は休眠状態を
維持する（Denlinger 2002）。体の小さい変温動物である昆虫は、休眠という仕組み
を獲得することで、温帯および高緯度地方への分布域の拡大が可能となったと考え
られる。
昆虫がどの発達段階で休眠に入るかは、種ごとに決まっている。卵、幼虫、蛹ま
たは成虫のいずれの場合もある（表 1-1）（Denlinger 2002, Mori et al. 1981, Miki et al.
2020, Saunders 1966, Tanaka 1966, Moribayashi 1950, 石黒ら 2015, Ikeno et al. 2010）。
表 1-1. 各昆虫の休眠ステージ
休眠ステージ
卵
幼虫
蛹
成虫
種
カイコ（Bombyx mori）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）
タンボコオロギ（Modicogryllus siamensis）、キョウソヤドリコバチ（Nasonia
vitripennis）
サクサン（Antheraea pernyi）、ニクバエ（Boettcherisca peregrina）
コガタルリハムシ（Gastrophysa atrocyanea）、ホソヘリカメムシ（Riptortus
pedestris）
1
休眠を誘導する環境情報には、日長、気温、餌の組成等があることが知られている
が、多くの昆虫では、季節変化を予測する指標として、気象条件に左右される気温
よりも、周囲の環境からの影響を受けない日長が利用されることが多い（Denlinger
et al. 2012）。例えば、蛹で休眠して越冬するタバコスズメガ（Manduca sexta）では、
卵期と幼虫期に経験する短日が蛹休眠を誘導する（ソーンダース 1981）。昆虫では、
複眼や単眼といった視覚系だけでなく、脳でも日長情報を受容する種が存在する
（ソーンダース 1981, Numata et al. 1997）。サクサン（Antheraea pernyi）、カイコ
（Bombyx mori）、アブラムシ（Megoura viciae）などは脳で、ホソヘリカメムシ
（Riptortus pedestris）やタンボコオオロギ（Modicogryllus siamensis）などは複眼で日
長情報を受容することが知られている（Williams and Adkisson 1964, Numata et al.
1997, Tomioka and Sakamoto 2007）。受容した環境情報を統合して休眠モードがプロ
グラムされると、そのプログラムをもとに内分泌系が調節される。内分泌系に関し
ては、幼若ホルモン（JH）、エクダイソン、前胸腺刺激ホルモン（PTTH）を介し
た休眠誘導過程が明らかにされている（Denlinger et al. 2012）。休眠誘導に関与する
ホルモンとその働き方は、種によって異なっている。ニカメイチュウ（Chilo
suppressalis）では JH の分泌によって幼虫休眠が誘導されるが（Yagi and Fukaya
1974）、ホソヘリカメムシでは JH の分泌抑制によって成虫休眠が誘導される
（Ikeno et al. 2010）。一方、ニクバエ（Sarcophaga argyrostoma）の蛹休眠やマイマ
イガ（Lymantria dispar）の幼虫休眠は、エクダイソンの分泌抑制によって誘導され
る（Richard et al. 1987, Denlinger et al. 1997）。
以上のように、環境情報の受容系と内分泌系に関しては研究が進んでいる。一方、
受容した環境情報を統合して休眠モードを決定する機構については、時計遺伝子の
2
RNA 干渉（RNAi）による機能抑制が日長応答性を撹乱させることから、日長の測
定に概日時計が関与することが示唆されている（Sakamoto et al. 2011, Ikeno et al.
2010）。また、最近の研究から、アカイエカ（Culex pipiens）ではインスリンシグナ
ル伝達系が、タンボコオロギでは JH シグナル伝達系が日長依存的な休眠制御関与
することが示唆されている（Sim and Denlinger 2009, Miki et al. 2020）。しかし、環
境刺激に依存的な休眠制御機構は外因性休眠において最も重要な仕組みであるにも
関わらず、その分子メカニズムに対する包括的な説明はまだなされていない。
カイコの休眠について
カイコは、数千年前に家畜化され、有用な絹糸昆虫として利用されてきた。カイ
コは飼育が容易であり、発育が斉一な個体を大量に準備することができる。そして、
大きな体サイズは解剖に向いており、バイオハザードの心配がないため、扱いが容
易である。カイコは実験動物としての利点が多いので、遺伝学、生理学のモデル動
物として古くから研究されており、遺伝情報や生理情報に関する知見が豊富である。
また、カイコは、チョウ目農業害虫とのゲノム類似性が高いことから、チョウ目害
虫のモデル動物とされている。最近では、薬物動態機構に哺乳類との共通性がある
ことが分かり、創薬研究のモデルとして活用されることも期待されている（Panthee
et al. 2017）。
カイコは卵で、つまり胚発生初期に細胞分裂が停止された状態で休眠する。カイ
コの卵休眠は、母性制御されている。外因性休眠を行う二化性の系統では、母蛾の
卵期と幼虫期に受容した環境情報が統合されて次世代卵の休眠モードが決定される
（Kogure 1933, Yamashita and Hasegawa 1966）。そして、決定された休眠モードをも
3
とに蛹期の内分泌系が調節され、休眠ホルモンの分泌の有無によって次世代卵が休
眠化または非休眠化される（図 1-1）（Fukuda 1951, 1952）。
図 1-1. 母親による次世代卵の休眠制御モデル
概日時計
卵期、幼虫期
日長（光）
気温
光受容器
脳
休眠決定中枢
環境情報の統合
休眠決定スイッチ
食餌
蛹期
内分泌系
次世代卵の
休眠化/非休眠化
卵休眠を誘導する刺激には、日長、気温、餌の組成等がある。母親の、卵期の高
温条件や幼虫期の短日条件が次世代卵の休眠化を誘導し、卵期が低温条件の場合や
幼虫期が長日条件の場合は非休眠卵となる傾向がある（Kogure 1933）。環境情報の
1
受容系については、前述したように、幼虫期の日長情報が脳の光受容器によって受
容される（Numata et al. 1997）。一方、卵期では、温度情報の受容に温度感受性
TRP チャネルが関与することが示唆されている（Sato et al. 2014）。また、桑葉と人
工飼料を用いた飼育実験から、餌の組成が次世代卵の休眠誘導に影響を与えること
が報告されている（Tsuchida and Yoshitake 1979）。カイコでは、組織培養実験等か
ら、休眠決定中枢が幼虫の脳に存在することが示されている（Hasegawa and Shimizu
1987）。
カイコは古くから休眠研究に用いられており、環境情報の入力系と内分泌系に関
しては研究が進んでいる。しかし、休眠決定機構に関しては未だに不明な部分が多
い。現在のところ、カイコでも日長の測定に概日時計が関与することが示唆されて
4
いるが（Ikeda et al. 2019）、他の昆虫において制御因子と考えられているインスリ
ンシグナル伝達系や JH シグナル伝達系の関与は確認されていない。
カイコの休眠研究から得られる成果は、昆虫の休眠制御メカニズムの解明に貢献
するだけでなく、産業分野への応用も期待される。休眠制御メカニズムを作用点と
する新たな害虫防除方法の開発や、カイコの飼育や保存等の管理事業の効率化に寄
与できる。以上の理由から、カイコの休眠制御機構の分子メカニズムを解明するこ
とは重要であると考えられる。
5
研究の流れ
カイコの休眠制御機構の分子メカニズムを解明するために、本研究では、網羅的
な遺伝子発現解析技術である DNA マイクロアレイ解析と CAGE 解析を用いて、休
眠制御関連遺伝のスクリーニングを試みた。
スクリーニングを行うにあたり、「休眠制御関連遺伝子は、休眠卵産下個体と非
休眠卵産下個体の間で発現差異を示す」という仮説を立てた。そこでまず、休眠誘
導刺激を調節して、休眠卵産下個体群（休眠群）と非休眠卵産下個体群（非休眠群）
を作成する。次に、２つの実験群間で、休眠制御中枢が存在する幼虫脳内の遺伝子
発現プロファイルを比較し、発現差異遺伝子を検索する。しかし、この方法では、
休眠制御とは関係のない遺伝子も多く含まれる可能性があり、候補遺伝子の絞り込
みが困難になる。例えば、温度を休眠誘導刺激として使用すると、休眠制御とは無
関係な温度依存的に発現変動を示す遺伝子も応答してしまう。休眠制御に関与しな
いこうした遺伝子を除去するために、本研究では、次の方法でスクリーニングを行
った（図 1-2）。実験グループごとに異なる刺激で休眠を誘導し、各実験グループ内
で休眠群と非休眠群の間で、発現差異を示す遺伝子を検索する。次に、各実験グル
ープから得られた発現差異遺伝子のうち、いずれの実験グループにも共通する遺伝
子を絞り込む。つまり、ここでは「休眠制御関連遺伝子は、休眠誘導刺激の種類に
かかわらず同じ発現変動パターン（増加または減少）を示す」という仮説を立てて
いる。
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図 1-2. スクリーニングの方法
各実験グループでは、
それぞれ異なる刺激を１つだけ調節して、休眠群と非休眠群を作成する。
卵期の温度を調節する
実験グループ
卵期の明るさを調節する
実験グループ
幼虫期の日長を調節する
実験グループ
休眠群と非休眠群の間で発現差異遺伝子を検索する。
発現差異
遺伝子群
（卵期の温度）
発現差異
遺伝子群
（卵期の明るさ）
発現差異
遺伝子群
幼虫期の日長
（
）
異なる実験グループに共通する遺伝子を絞り込む。
発現差異遺伝子群
（卵期の明るさ）
発現差異遺伝子群
（卵期の温度）
発現差異遺伝子群
（幼虫期の日長）
休眠制御関連遺伝子の候補
刺激の種類にかかわらず、いずれの刺激に対しても同じ発現変動パターンを示す遺伝子。
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本研究では最初に、スクリーニングに必要となる、休眠制御可能な系統の選別か
ら着手した。二化性系統を対象として、卵期の温度、卵期の明るさ、および幼虫期
の日長を調節して、休眠応答性を調べた。そして、3 種類の刺激のいずれに対して
も厳密な休眠制御が可能な系統を選別した。
スクリーニングでは、ゲノムワイドな遺伝子発現の解析に、DNA マイクロアレ
イ解析と CAGE 解析を使用した。実験に用いた休眠誘導刺激は、DNA マイクロア
レイ解析を使用したスクリーニングでは、卵期の温度、または卵期の明るさの２種
類、そして、CAGE 解析を使用したスクリーニングでは、卵期の温度、卵期の明る
さ、または幼虫期の日長の３種類であった。CAGE 解析を用いたスクリーニングか
ら得られた候補遺伝子に対しては RNAi 実験を行い、休眠制御に本質的に関与して
いるかどうかを検証した。
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論文の構成
第２章では、スクリーニングに必要となるカイコ系統の選別と飼育条件の確立に
ついて述べる。二化性と考えられている 10 系統を対象とし、卵期の温度、卵期の明
るさ、及び幼虫期の日長を調節して、休眠応答性を調べた。３種類の刺激のいずれ
に対しても厳密な休眠制御が可能な系統を選別した
第３章では、DNA マイクロアレイ解析を使用したスクリーニングについて述べ
る。休眠誘導刺激として、卵期の明るさ、または卵期の温度を用いた２つの実験グ
ループを作成した。各実験グループ内で、幼虫脳内の遺伝子発現プロファイルを、
休眠群と非休眠群間で DNA マイクロアレイ解析を使用して比較解析し、発現パタ
ーンが異なる遺伝子群を検索した。そして、休眠誘導刺激の異なる２つの実験グル
ープで、同様な発現変動パターンを示す遺伝子を絞りこんだ。
第４章では、CAGE 解析を使用したスクリーニングについて述べる。休眠誘導刺
激として、卵期の明るさ、卵期の温度、または幼虫期の日長を用いた３つの実験グ
ループを作成した。各実験グループ内で、幼虫脳内の遺伝子発現プロファイルを、
休眠群と非休眠群間で CAGE 解析を使用して比較解析し、発現パターンが異なる遺
伝子群を検索した。そして、休眠誘導刺激の異なる３つの実験グループで、同様な
発現変動パターンを示す遺伝子を絞りこんだ。得られた候補遺伝子に対しては、
RNAi による機能解析を行った。
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第５章では、第２-４章の内容をもとに、スクリーニングから得られた候補遺伝子
についての総合的な考察を述べる。
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第２章
休眠制御可能なカイコ系統の選別
背景
カイコは卵で休眠し、二化性系統では、母親が卵期と幼虫期に経験した環境刺激
をもとに次世代卵の休眠モードが決定される（Kogure 1933, Yamashita and Hasegawa
1966）。第１章で述べたように、本研究では休眠制御関連遺伝子を検索するために、
休眠卵産下群（休眠群）と非休眠卵産下群（非休眠群）の間で発現差異を示す遺伝
子をスクリーニングする。実験群を作成するためには、厳密な休眠制御が可能な系
統、つまり適当な刺激を与えることで次世代卵の休眠率を 0%（非休眠）または
100%（休眠）に制御できる系統が必要である。
本章では、スクリーニングに必要なカイコ系統を選別した過程とその結果につい
て述べる。二化性の 10 系統に対して、母親の卵期および幼虫期の環境条件（卵期の
温度と明るさ、および幼虫期の日長）を調節して次世代卵の休眠応答性を調べ、
我々の実験室環境で厳密な休眠制御が行える系統を選別した。 ...
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