Mechanisms of action of insulin-like growth factor on growth variation in bivalves

概要

二枚貝の胚や幼生の凍結保存は、季節に関係なく種子を得ることができるため、多くの利点がある。これは水産養殖のより良い管理を可能にし、そして高品質または固有の系統および品種の保存につながる。二枚貝の凍結保存技術は水産養殖業の改善に役立つかもしれない。二枚貝の胚と幼生の凍結保存は、異なる凍結保護剤（CPA）とさまざまな凍結・融解速度を用いて、そして複数の種において、いろんな発生段階にわたって研究されてきた。しかし、凍結融解した胚や幼虫は発育を停止したり不安定な生存を示すことがあるので、凍結保存は必ずしも肯定的な反応をもたらすわけではない。これは、練結保存された胚または幼生が水産養殖で商業的に使用されていないという主な問題の1つである。したがって、まず初めに凍結融解胚および幼生の持続可能な成長を評価するための指標について検討が必要である。

成長因子は特定の組織の成長を刺激するタンパク質である。成長因子は細胞分化および細胞分裂を促進するのに重要な役割を果たし、それらは様々な生物に存在する。インシュリン様成長因子（IGF)は、下種体からの成長ホルモン分泌を媒介することによって成長を刺激する。「GF系は脊椎動物の発生および成長を制御するのに重要な役割を果たし、中でも「GFーIは魚類の成長の指標として使用されている。しかし、無脊椎動物では、伝統的なIGF、IGF受容体およびIGF結合タンパク質(IGFBP) が存在するという明確な証拠はないものの、大量のインシュリン様ペプチド(ILP) が発現し、それらは成長、代謝、脱皮、および再生を含むさまざまな生物学的プロセスで機能する可能性が示唆されている。特に、軟体動物のインシュリン関連ペプチド（MIP) 、Crassostrea gigasインシュリン受容体関連受容体（CIR)、IGFBPおよびIGFBP関連タンパク質に関する研究が無脊椎動物で報告されている。しかしながら、毒性の強いCPAや低温によって引き起こされるもののような極端なショック状態の間の個人におけるIGF （二枚貝のMAIP）、IGF-IR （二枚貝のCIR) およびIGFBPの関与と作用機序を調査した研究はほとんどない。二枚貝の生育状況や生育状況が異なる。したがって、私は、IGFの発現がCPAの影響と、胚または幼生の生存率および成長率の違いに対する凍結に関連していると仮定した。この仮説を検証するために、1)2種の二枚貝（バカガイMactra chinensisおよびホッキガイ Spisula sachalinensis)の凍結保存した胚幼生の生存とIGFとの関係、2) マガキC.gigasの成長変動とIGF情報伝達経路との関係について明らかにするとともに、IGF情報伝達経路の作動状況を二枚貝幼生の生存能の指標として用いる手法の開発を目指した。

第2章、第1節では、M. chinensisにおける凍結保護剤（CPA：グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO） およびエチレングリコール(EG) ） の毒性ならびに胚発生および凍結後の増殖中のIGF-Iの役割について検討した。すなわち、異なる濃度のCPAと凍結後の胚の生存率とIGF-「受容体情報伝達との関係についてimmunoblotting分析を用いて調べた。グリセロールが最も高い毒性を示し、DMSOまたはEGがそれに続いた。無CPAでは凍結・融解後に生き残った胚はなかった。凍結後IGF-IRB-サブユニットを含むIGF-［シグナル伝達経路の活性化が検出された。ヘ結-解凍した胚ではIGF-IR発現は非常に弱く、胚の生存率および発生率はCPA濃度と密接に関連していた。IGF-IRの活性化の低下が凍結-融解胚における低い生存率を引き起こす可能性が示唆された。

第2章、第2節では、S.sachalinensisの幼生において、CPA処理および凍結後の幼生の生存率とIGF-IRとの間の関係を調べた。CPAの毒性およびS.sachalinensis 幼生の急速凍結によるガラス化の影響を調べるとともに、IGF-IR発現状況をimmunoblottingで調べた。4 Mを超える濃度のDMSOは幼生にとって致死的であり、5 MのEGは有害な影響を及ぼさず、形態的にも無傷のままであった。しかしながら、幼生がC PA毒性試験を生き残ったとしても、急速凍結によってガラス化した幼生は生残しなかった。CPAへの浸漬およびガラス化の後、97k DaのIGF-IR B-サブユニットの発現はすべての幼生において検出されたが、細胞内ーサブユニットのチロシンリン酸化は対照および生存群においてのみ検出され、CPAおよび急速凍結によるガラス化ではIGF-IRの活性化が起こらないことが明らかとなった。

韓国では、C. gigasは重要な水産養殖種であり、その成長は環境条件に依存している。カキの成長を評価するための指標として使用できる生体内情報伝達にかかわる因子は非常に少ない。そこで第3章、第1節では、IGF-L、IGF-IR (Crassostrea gigas インシュリン 受容体関連受容体、CIR) およびIGFBP-complex acid labile subunit (ALS)レベルを、immunoblottingおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用い、冬季のC. gigasの内転筋において評価した。IGF-IおよびIGF-IRB-サブユニット、ならびにCIRおよびIGFBP-AIS mRNAの発現レベルは、小さい個体(ST) よりも大きい個体（LI) において有意に高かった。IGF-IRB-サブユニットは両群の内転筋で検出されたが、ICR-IRB-サブユニットおよび細胞外シグナル調節キナーゼのリン酸化は、SIよりもLIにおいて大きかった。本研究の結果は、IGF情報伝達経路の作動状況が冬季のC. gigasの成長率の違いにつながることを示唆している。

C. gigasの閉殼筋は、刺激に反応して弁を開閉するのに重要な役割を果たしている。それは季節的なエネルギー貯蔵庫であり、その状況は生殖および環境要因（温度、pH、および栄養）に依存するelectronspray ionization quadrupole time-of flight mass spectrometry用いて閉穀筋の7つのタンパク質を同定し、それらのタンパク質のCI発現レベルとmRNA発現レベルの関係について明らかにするとともに。MIP、CIR、およびIGFBP-ALSのmRNA発現も調べた。CIの月ごとの変化は組織重量率（TWR)の変化と同様に推移し、CIとTWRの値は産卵期直前まで増加して、産卵期（6月と7月）に急激に減少した。さらに、MHC、FIL-C、PEPCK、 RALDH 1、 ACT 2、AK、およびaCBのmRNA発現レベルは、1年間の研究期間中毎月変化した。これらの遺伝子の発現は、C. gigasが成熱する5月に最高値を示し、7月と9月も高値を示した。MIP、CIRおよびIGFBP-ALSのmRNA発現レベルは、他の月より7月で有意に高かった。さらに、CIRとIGFBP-ALSのmRNA発現レベルは類似していた。本研究で調査した遺伝子の発現レベルの変化は、韓国のTon gyeongで培養されたC.gigasの年間成長、成熟度および産卵期間を決定するために有用な指標として使用することができるものと考えられた。

第3章、第3節では、三倍体のマガキC. gigasの閉散筋における筋形成、成長および運動能との相関の可能性を確かめるために、IGF-I/protein kinase B （AKT) シグナル伝達経路を調べた。同一条件下で培養した大型および小型三倍体カキ(それぞれLTおよびST) をスクリーニングし、優れた成長を有する個体の情報伝達経路の作動状況を比較した。筋形成に重要なタンパク質であるアクチン、トロポニン、トロポミオシンおよびミオシンのmRNAおよびタンパク質発現レベルは、STよりもIT で高かった。IGF-I、IGFBPおよびIGFBP-AISの発現レベルもまた、STよりもLTの方が高かった。IGF-I情報伝達経路を開始するIGF受容体ならびにAKTのリン酸化は、LTにおいて高かった。これらの結果は、IGF-I／AKTシグナル伝達経路が三倍体カキにおける内転筋の形成および成長に関与していることを示唆する。さらに、target of rapamycinおよびglycogen synthase kinase 3B (GSK3R)の発現が上昇し、筋肉タンパク質の合成および分解に関与するAKTのサブファクターであるForkhead box03の発現がLTにおいて減少した。筋形成および運動と関連して、peroxisome proliferator activated receptor y coactivator-laの発現増加を介した神経Wiskott-Aldrichsyndrome protein およびtroponinの増加が観察された。これらの結果から、IGF-I／AKT情報伝達経路は、三倍体マガキの形成、成長および内転筋の形成に関連している可能性があると考えられた。

第3章、第4節では、増殖評価指標としてC. gigasのIGF情報伝達経路の作動状況を迅速に検出するためのmultiplex PCRの適用を目指した。IGFの発現は、貝類ならびに魚類における増殖、分化および成長の内分泌調節において重要な役割をする。C.gigasは、韓国の貝類産業の大部分を占める重要な水産養殖種であり、その成長は養殖業にとって経済的に重要である。しかしながら、貝類の成長率を測定する場合、殻が大きく軟部組織重量を非破壊で測定することが困難である。本節では、multiplex PCRを使用して成長速度を測定し、C. gigasのMIP、IGFBP-ALSおよびCIRのレベルを分析するための方法を開発した。MIPおよびIGFBP-AIS遺伝子の年間組織発現は、CIと同じ傾向に従って、冬季に高レベルに達した。雄性生殖腺におけるMIPおよびIGFBP-AISの発現および雌性生殖腺におけるCIRの発現はCIと相関していた。この新しいmultiplexPCR法は増殖速度を推定する指標として有用であると考えられた。

これらの結果は、IGF発現レベルおよびIGF情報伝達経路の作動状況が、これまで困難であった二枚貝の成長や成熟程度の判断を可能とする指標となる可能性を示したものであり、水産無脊椎動物養殖に資するものと考える。

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