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ファイトプラズマの昆虫体内における微細動態解析

鯉沼, 宏章 東京大学 DOI:10.15083/0002004906

2022.06.22

概要

植物病を引き起こす病原体の中には、昆虫を介して感染植物から別の植物へと伝染するものが存在する。これらの植物病原体は、主に植物の汁液を吸汁して生活するアブラムシやヨコバイといった吸汁性昆虫により媒介され、一部は媒介時に昆虫の体内を循環する。すなわち、病原体が植物の汁液を介して昆虫に取り込まれると、まず消化管に侵入する。その後、消化管組織を通過して血体腔へと進出し、血リンパの流れに乗って唾腺へと到達・侵入する。最終的に、病原体は唾液とともに新たな植物に侵入・感染する。この体内循環を成立させる上で、病原体による消化管と唾腺の通過は重要なプロセスであるが、病原体の動態に関する知見は乏しく、特に昆虫媒介性の植物病原細菌において不明な点が多い。

ファイトプラズマは1000種以上の植物に感染して農業生産上甚大な被害を引き起こす、モリキューテス綱に属する植物病原細菌の一群である。ファイトプラズマは植物の篩部に局在し、ヨコバイ等の吸汁性昆虫の体内を循環することにより媒介される。ファイトプラズマの昆虫媒介機構に関しては、これまで電子顕微鏡観察やPCRを中心に各昆虫組織におけるファイトプラズマの有無や局在部位が調べられ、ELISA等により蓄積量が定量されてきた。しかし、これらの解析が基本的に個別に行われてきたこと、また体内循環初期からの経時的な解析例が少ないことから、昆虫組織内でのファイトプラズマの詳細な動態はほとんど明らかになっていない。特に消化管と唾腺を通過する際の、経時的な局在や蓄積量の変化は不明である。そこで本研究では、媒介昆虫体内におけるファイトプラズマの詳細な動態を明らかにすることを目的として、ファイトプラズマの昆虫器官における動態を、免疫蛍光染色技術と定量PCRを組み合わせて経時的に解析した。

1.タマネギ萎黄病(OY)ファイトプラズマの媒介昆虫体内の各器官における量的変動解析

まず当研究室で維持しているタマネギ萎黄病(onionyellows:OY)ファイトプラズマとその媒介昆虫ヒメフタテンヨコバイ(Macrostelesstriifrons)を用いて、媒介昆虫におけるファイトプラズマDNAの経時的な定量を試みた。ファイトプラズマ感染植物を吸汁(獲得吸汁)した後のヒメフタテンヨコバイを1週間おきに採取し、虫体全体からDNAを抽出し、ファイトプラズマDNA蓄積量をリアルタイムPCRにより解析した。その結果、獲得吸汁開始から7、14、21、28日後のファイトプラズマDNAの相対的な蓄積量は、7日後から21日後にかけては約2倍ずつ増加し、21日後から28日後にかけて約7倍に増加した。

続いてファイトプラズマが感染する主要な部位と考えられる消化管、血体腔、唾腺において、ファイトプラズマDNA蓄積量の経時的変化を解析した。獲得吸汁開始から7、14、21、28日後に回収した昆虫から消化管および唾腺を解剖により取り出してDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供試した。血体腔における定量は、脚部を用いて同様に行った。その結果、ファイトプラズマDNAの相対的な蓄積量は、消化管では7日後から21日後にかけて約6倍に増加し、21日後から28日後は同程度に維持された。一方、血体腔および唾腺では7日後での蓄積量は極めて低かったが、7日後から28日後にかけて約10–40倍ずつ増加し、最終的には消化管における28日後の蓄積量と同程度に達した。従って、OYファイトプラズマはヒメフタテンヨコバイ体内において獲得吸汁開始から7–28日後にかけて増殖し、部位ごとで見ると、感染初期の7–21日後に消化管で増殖し、21–28日後には血体腔および唾腺での蓄積量が増大することが示唆された。

2.OYファイトプラズマの媒介昆虫体内の各器官における局在変動解析

ヒメフタテンヨコバイの消化管と唾腺におけるOYファイトプラズマの局在を明らかにするため、経時的な免疫組織化学染色を行った。ファイトプラズマは細胞壁を持たず、菌体表面が主に主要抗原膜タンパク質と呼ばれる膜タンパク質に覆われると考えられている。そこでOYファイトプラズマ菌体の標識には、蛍光色素を直接結合させた主要抗原膜タンパク質Ampに対する抗体を用いた。非感染ヨコバイ(ネガティブコントロール)と1ヶ月以上OYファイトプラズマ感染植物を吸汁したOY感染ヨコバイ(ポジティブコントロール)について、解剖して消化管を取り出し、上記の抗体による免疫染色に供試した。その結果、OY感染ヨコバイ特異的に蛍光が観察され、本抗体によるファイトプラズマの検出が可能と判断された。

ヒメフタテンヨコバイの消化管は食道、濾過室、中腸、後腸から構成され、中腸はさらに最も幅が広い中腸前部、その後に続く幅の狭い中腸中部、中腸後部に分けることができる。確立した免疫染色系を用いて、獲得吸汁開始から7、14、21、28日後に回収したヨコバイの消化管におけるファイトプラズマの局在解析を行った結果、OYファイトプラズマは全期間を通じて中腸前部に最も頻繁に局在した。中腸は一層の上皮細胞からなり、内側には微絨毛が、血体腔に面する外側には基底膜が存在する。また、基底膜のさらに外側は内臓筋で覆われている。OYファイトプラズマは獲得吸汁開始から7日後に中腸前部の上皮細胞内に観察され、14日後およびそれ以降では内臓筋にも観察された。内臓筋を構成する2種類の筋繊維(内側の環状筋と外側の縦走筋)のうち、OYファイトプラズマの蛍光は14日後には環状筋のみに見られたが、21日後には環状筋と縦走筋の両方、28日後にはこれらの筋繊維に沿って広範囲に観察された。従って、ヒメフタテンヨコバイに取り込まれたOYファイトプラズマは、まず獲得吸汁開始から7日後までに中腸前部に到達して上皮細胞内に侵入し、その後、14日後には上皮細胞内のファイトプラズマが基底膜の方へと移動し、その一部が基底膜を通過して環状筋に局在し始め、21日後には環状筋の外側にある縦走筋にも局在し、28日後にはこれらの内臓筋に沿って広がると考えられた。

次に、唾腺についても消化管と同様に免疫染色系を用いて、経時的な局在解析を行った。ヒメフタテンヨコバイの唾腺は6種類の細胞型(タイプI–VI細胞)に分けられる。獲得吸汁開始から7、14、21、28日後に回収した唾腺において、OYファイトプラズマは14日後およびそれ以降に蛍光が観察され、それら全ての個体でタイプIII細胞に局在が認められた。そこで、タイプIII細胞に注目して局在を観察した。タイプIII細胞は一層の分泌細胞からなり、細胞の内側には唾液で満たされた細胞内細管が存在する。OYファイトプラズマの蛍光は獲得吸汁開始から14日後にタイプIII細胞の表面に観察され始め、21日後には蛍光が観察される頻度や蛍光強度も増大した。しかしこの時点では、細胞内部に蛍光が観察される頻度は少なかった。28日後には、細胞質にも観察されるようになり、細胞内細管の近くにも存在した。以上から、OYファイトプラズマはヒメフタテンヨコバイの獲得吸汁開始から14日後にタイプIII細胞に到達し始め、その後表面に蓄積し、28日後にはその一部が細胞内部に侵入し、細胞内細管に向かって移動していくことが示唆された。

蛍光観察と定量PCRを用いた解析により、消化管と唾腺におけるファイトプラズマの局在および蓄積量の経時的な変化が明らかになった。これらの結果を元に、OYファイトプラズマの媒介昆虫における経時的な動態モデルを構築した。すなわち、OYファイトプラズマは獲得吸汁開始から7日後までに消化管の中腸前部の上皮細胞に侵入し、7–14日後にかけて上皮細胞内で増殖する。14–21日後には中腸前部の基底膜を通過して内臓筋、そして血体腔へと移動する。最終的に、21–28日後に唾腺のタイプIII細胞へと到達し、分泌細胞内に侵入・蓄積する。加えて、本研究によりOYファイトプラズマが中腸前部の内臓筋に沿って移動することやタイプIII細胞への侵入には細胞表面での蓄積が重要であることが示唆された。

本研究では、媒介昆虫におけるファイトプラズマの時空間的・定量的な動態を初めて包括的に明らかにした。本知見はファイトプラズマを始めとする植物病原細菌の昆虫内動態の理解に貢献するとともに、ファイトプラズマが消化管と唾腺を通過する際の詳細な分子メカニズムを解明する上で、基盤的な役割を果たすことが期待される。

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