糸状菌の細胞壁α-1,3-グルカンの生合成を制御するGPIアンカー型α-アミラーゼの生物学的及び酵素学的機能の解析
概要
令和五年度 博士論文
糸状菌の細胞壁 α-1,3-グルカンの生合成を制御する
GPI アンカー型 α-アミラーゼの
生物学的及び酵素学的機能の解析
東北大学大学院農学研究科
生物産業創成科学専攻
小泉 亜未
指導教員
阿部 敬悦 教授
目次
略語表 .............................................................................................................................. 5
序章 .................................................................................................................................. 7
第 1 節 背景 ............................................................................................................... 7
第 2 節 実験材料および基本的手法 ...................................................................... 11
0-2-1 試薬 ............................................................................................................. 11
0-2-2 菌株 ............................................................................................................. 11
0-2-3 培地 ............................................................................................................. 11
0-2-4 遺伝子実験 .................................................................................................12
0-2-4-1 E. coli のコンピテントセルの作製 ...................................................12
0-2-4-2 E. coli の形質転換法 ...........................................................................13
0-2-4-3 プラスミドの回収 ..............................................................................13
0-2-4-4 アガロースゲル電気泳動による DNA の解析 ................................13
0-2-4-5 制限酵素による DNA の切断 ............................................................14
0-2-4-6 PCR ......................................................................................................14
0-2-4-7 ベクターDNA, インサート DNA の調製 ..........................................14
0-2-4-8 DNA シークエンシング .....................................................................14
0-2-5 A. oryzae および A. nidulans に関する手法..............................................15
0-2-5-1 分生子懸濁液の調製 ..........................................................................15
0-2-5-2 ゲノム DNA の抽出 ............................................................................15
0-2-5-3 Total RNA の抽出 ...............................................................................16
0-2-5-4 cDNA の合成 .......................................................................................16
0-2-5-5 糸状菌の形質転換法(プロトプラスト・PEG 法) ......................17
0-2-6 P. pastoris に関する手法 ............................................................................19
0-2-6-1 P. pastoris の形質転換法 .....................................................................19
0-2-6-2 P. pastoris のゲノム DNA の抽出 .......................................................19
0-2-7 タンパク質実験 .........................................................................................19
0-2-7-1 タンパク質量の定量 ..........................................................................19
0-2-7-2 SDS-PAGE ...........................................................................................20
0-2-7-3 ウエスタンブロッティング ..............................................................21
2
0-2-8 統計分析 .....................................................................................................24
第 3 節 AoAgtA の配列解析と立体構造予測 ........................................................24
第 1 章 AoAgtA の生物学的機能解析........................................................................36
第 1 節 緒言 ..............................................................................................................36
第 2 節 実験材料および方法 ..................................................................................36
1-2-1 A. oryzae における agtA 高発現株の作製.................................................36
1-2-2 A. oryzae における agtA 破壊株の作製.....................................................37
1-2-3 液体培養における A. oryzae および A. nidulans の表現型の観察 .........37
1-2-4 A. oryzae および A. nidulans 菌糸中の α-1,3-グルカンの抽出 ...............37
1-2-5 A. oryzae および A. nidulans 菌糸中の α-1,3-グルカン量の定量 ...........38
1-2-6 A. nidulans における agtA 高発現株の作製 .............................................39
1-2-7 アルカリ可溶性グルカンの平均分子量の決定 ......................................40
第 3 節 実験結果 ......................................................................................................41
1-3-1 A. oryzae の agtA 高発現株の解析.............................................................41
1-3-2 A. nidulans の agtA 高発現株の解析 .........................................................41
第 4 節 小括 ..............................................................................................................43
第 2 章 組換え酵素を用いた AoAgtA の酵素学的機能解析 ...................................52
第 1 節 緒言 ..............................................................................................................52
第 2 節 実験材料および方法 ..................................................................................52
2-2-1 Anti-AoAgtA 抗体の作製 ..........................................................................52
2-2-2 組換え AoAgtA 発現 P. pastoris 株の作製 ................................................52
2-2-3 高速液体クロマトグラフィーの分析条件 ..............................................53
2-2-4 組換え AoAgtA 活性測定法 ......................................................................56
2-2-5 組換え AoAgtA 発現 P. pastoris 株の培養方法と培養時間の検討.........56
2-2-6 組換え AoAgtA の精製 ..............................................................................57
2-2-7 基本的な酵素学的特性の解析..................................................................57
2-2-8 基質特異性解析 .........................................................................................58
2-2-9 p-ニトロフェニル α-マルトオリゴシドの酵素合成 ..............................59
2-2-10 マルトオリゴ糖とそれらの p-ニトロフェニル誘導体における切断様
式解析 .....................................................................................................................60
2-2-11 反応速度論解析........................................................................................60
3
2-2-12 組換え AoAgtA 活性におけるニゲロオリゴ糖の影響.........................61
2-2-13 3-α-マルトオリゴシルグルコースの酵素合成 .....................................61
2-2-14 3-α-マルトテトラオシルグルコースに対する組換え AoAgtA の挙動
解析 .........................................................................................................................62
第 3 節 実験結果 ......................................................................................................62
2-3-1 P. pastoris において生産した組換え AoAgtA ..........................................62
2-3-2 基本的な酵素学的特性の解析..................................................................63
2-3-3 基質特異性解析 .........................................................................................63
2-3-4
マルトオリゴ糖とそれらの p-ニトロフェニル誘導体における切断様
式解析 .....................................................................................................................64
2-3-5 反応速度論解析 .........................................................................................64
2-3-6 組換え AoAgtA 活性におけるニゲロオリゴ糖の影響 ..........................65
2-3-7 3-α-マルトオリゴシルグルコースは組換え AoAgtA の基質である ....65
第 4 節 小括 ..............................................................................................................66
終章 考察 .....................................................................................................................84
総括 .................................................................................................................................91
引用文献 .........................................................................................................................92
公表論文 .........................................................................................................................98
謝辞 .................................................................................................................................99
4
略語表
aa : Amino acid(s)
APS : Ammonium peroxodisulfate
BSA : Bovine serum albumin
CBB : Coomassie Brilliant Blue
CD : Czapek–Dox
cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid
DEPC : Diethylpyrocarbonate
DMAc : N,N-dimethylacetamide
DMSO : Dimethyl sulfoxide
DNA : Deoxyribonucleic acid
DP : Degree of polymerization
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
GH13 : Glycoside hydrolase family 13
GPC : Gel permeation chromatography
GPI : Glycosylphosphatidylinositol
HPAEC-PAD : High-performance anion-exchange chromatography with pulsed
amperometric detection
HPLC : High-performance liquid chromatography
Maln : Maltooligosaccharide
Mn : Number-average molecular weight
MOPS : 3-Morpholinopropanesulfonic acid
MW : Molecular weight
Mw : Weight-average molecular weight
Na-Ac : Sodium acetate
ORF : Open Reading Frame
PBS : Phosphate buffered saline
PCR : Polymerase chain reaction
PNM or Maln-α-pNP : p-Nitrophenyl α-maltooligoside
pNP : p-Nitrophenyl group
PVDF : Poly(vinylidene fluoride)
5
RI : Refractive index
RNA : Ribonucleic acid
SDS : Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE : Sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
TBS : Tris-buffered saline
TEMED : N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine
Tris : Tris(hydroxymethyl)aminomethane
UV : Ultraviolet
6
序章
第 1 節 背景
真菌の細胞壁は、細胞のストレスから保護や細胞形態の維持、細胞外情報の細
胞内への伝達などの多様な機能を有しており、その主成分は多糖である(Latgé,
2010; Yoshimi et al., 2016)
。真菌の中で Aspergillus 属菌の細胞壁は、細胞膜に近い
内層に存在する β-1,3-グルカン(β-1,6-分岐を含む)やキチン、細胞壁外層に存在
する α-1,3-グルカン(少ない割合の α-1,4-グルカンを含む)
、細胞外マトリックス
等から構成される(Latgé, 2010; Yoshimi et al., 2016; Figure 0-1)
。α-1,3-グルカン
は、出芽酵母には含まれない Aspergillus 属菌などの一部の糸状菌が持つ細胞壁成
分である。従来、α-1,3-グルカンの機能としては、ヒト感染性真菌や植物病原菌
などの病原性真菌において、β-1,3-グルカンやキチンを被覆することで、宿主の
免疫システムによる認識を防ぐ免疫応答回避因子として働くことが報告されてき
た(Rappleye et al., 2004, 2007; Fujikawa et al., 2009, 2012; Beauvais et al., 2013)
。一
方で非病原性の真菌においても α-1,3-グルカンを有する種が多数存在することか
ら、α-1,3-グルカンは病原性以外の機能も有すると考えられていた。モデル糸状
菌 Aspergillus nidulans には 2 つの α-1,3-グルカン合成酵素遺伝子(agsA, agsB)が
存在する。当研究室では、agsB 破壊株において α-1,3-グルカンが細胞壁から欠失
しており、菌糸が液体培地中に分散する形質を示すことを明らかにした
(Yoshimi et al., 2013)
。こうして、α-1,3-グルカンは菌糸凝集の接着因子であるこ
とが明らかになった(Yoshimi et al., 2013)
。 ...