論文の公開元へ日本人侵襲性歯周炎の疾患関連遺伝子 Lipase-Aのヒト歯根膜細胞における機能解析
概要
【研究目的】
侵襲性歯周炎は、全身的に健康であるが急速な歯周組織の破壊を示すことを特徴とする疾患である。また、家族内集積を認めることから、本疾患の病態形成には遺伝的要因の関与が示唆されている。これまでに侵襲性歯周炎の疾患関連因子として炎症性サイトカイン(TNF-αや7Z-7)等の一塩基多型(SNP : Single Nucleotide Polymorphism)が報告されてきたが、未だ疾患との明確な関連を見出すには至っていない。この理由として、従来の侵襲性歯周炎関連遺伝子の探索に関する研究は、骨や炎症に関連する特定の遺伝子に焦点を絞り、疾患との関連性や機能解析を行ったものがほとんどであり、未知の領域にまで踏み込んだ網羅的な解析が行われてこなかったことが挙げられる。そこで本研究では、エクソームシークエンス解析を用いたゲノムワイドアプローチを推進することで、日本人侵襲性歯周炎関連遺伝子の探索を行った。その結果、侵襲性歯周炎関連候補遺伝子の一つとして Lipase A (LIPA)のSNP rsl43793106を抽出した。LIPAはLysosomal Acid Lipase (LAL)というタンパク質をコードする遺伝子で、LALはリソソームにおいて、トリグリセリド及びコレステリルエステルを加水分解する役割を持つ。これまでの研究において、LALの機能低下が原因で発生するウォルマン症において、副腎の石灰化が発生することが報告がされている。しかしながら、歯周組織構成細胞におけるLIPA発現及びその石灰化に関連する機能は未だ不明である。そこで我々は、ヒト歯根膜細胞(HPDL)におけるLIPAの発現及びLIPAが同細胞の硬組織形成に及ぼす機能を解析することを目的として研究を行った。
【方法】
(1) ゲノムワイドアプローチを用いた日本人侵襲性歯周炎の疾患関連候補遺伝子の探索
大阪大学歯学部附属病院口腔治療・歯周科を受診し、日本歯周病学会の定義に従い侵襲性歯周炎と診断された患者の中から、本研究への参加応諾した者を被験者とした(大阪大学ヒトゲノム研究承認番号629-2)。被験者より採血を行い、末梢血よりゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを用いてエクソームシークエンス解析を行った。解析の結果得られた遺伝子を、①1000ゲノムデータベースにおけるSNP発現頻度が5 %以下、②深度10以上、③4検体以上で検出、④タンパク質に異常を引き起こす、という条件で絞り込みを行った。さらに、疾患群と対照群(日本人健常者ゲノムデータベース：integrative Japanese Genome Variation Database (iJGVD ))のマイナー対立遺伝子頻度(MAF)を比較し、統計学的有意差(p く 0.05)を認める遺伝子を日本人における侵襲性歯周炎の疾患関連候補遺伝子として同定した。
(2) HPDLにおけるLIPA mRNAの発現検討
HPDLにLIPA mRNA及びLALが恒常的に発現していることを、Real-time PCR法及びウエスタンブロット法を用いて 検討した。さらに、HPDL を石灰化誘導培地(10% FCS、10 mM β-glycerophosphate、50 gg/ml ascorbic acid 含有 αΜΕΜ)存在下にて硬組織形成細胞へと分化誘導した際の、アルカリホスファターゼ(ALP)及びLIPAのmRNA発現の経時的変化を、Real-time PCR法を用いて検討した。
(3) HPDLの硬組織形成細胞への分化過程におけるZ™ SNP rsl43793106の機能解析
LIPA 野生型(WT)及び変異型(mut)発現レンチウイルスベクターをHPDLに遺伝子導入した。コントロールには Empty Vector (EV)導入HPDLを用いた。遺伝子導入後、ウエスタンブロット法を用いてLIPA WT. mut、及びEV導入 HPDLにおけるLALの発現を比較検討した。LIPA WT、mut、及びEV導入HPDLにおけるLALの酵素活性を、LysoLive™ Lysosomal Acid Lipase Assay Kitを用いてフローサイトメトリー法により測定した。加えて、石灰化誘導培地にて、LIPA WT、mut、及びEV導入HPDLを硬組織形成細胞へと分化誘導し、ALP活性の測定、アリザリンレッド染色による石灰化物形成能の検討、及び、Real-time PCR法による石灰化関連遺伝子であるI型コラーゲン(C0L1A1)の発現検討を遂行した。
【結果】
(1) ゲノムワイドアプローチを用いた日本人における侵襲性歯周炎の疾患関連候補遺伝子の探索
ゲノムワイドアプローチを用いたエクソームシークエンス解析の結果、44名のΗ本人侵襲性歯周炎患者より、一人当たり約78000個の疾患関連候補遺伝子が得られた。①〜④の条件で絞り込みを行った結果、48個の疾患関連候補遺伝子が抽出された。さらに、疾患群と対照群におけるMAFを比較した結果、発現頻度に統計学的有意差を認めた11個の疾患関連候補遺伝子が抽出された。この遺伝子群の中から、LIPA(D SNP rsl43793106 (c.1009T>C, p. Thr337Ala)に着目した。侵襲性歯周炎疾患群におけるLIPA SNP rsl43793106のMAFは4. 55%であったのに対し、対照群でのMAFは1.66%であり、p値は0. 037、オッズ比は2.82、95%信頼区間は1.02-7.81であり、疾患群と対照群の間でSNPの発現頻度に有意差を認めた。
(2) HPDLにおけるLIPA mRNAの発現検討
Real-time PCR解析及びウエスタンブロット解析の結果、HPDLにおいてLIPA mRNA及びLALの恒常的な発現を認めた。また、HPDLの硬組織形成細胞への分化に伴い、石灰化関連遺伝子であるALPのmRNA発現の有意な上昇を認めた。同様に、LIPAのmRNA発現も、HPDLの硬組織形成細胞への分化に伴って有意に上昇することが明らかとなった。
(3) HPDLの硬組織形成細胞への分化過程におけるLIPA SNP rsl43793106の機能解析
ウエスタンブロット解析の結果、LIPA WT及びmutを導入したHPDLにおいて、EV導入HPDLと比較して、LALの夕ンパク発現が著しく高いことを確認した。HPDLにおけるLAL酵素活性測定の結果、LIPA WT及びmut導入HPDLにおいて、EV導入HPDLと比較してLALの酵素活性の有意な上昇を認めた。一方、LIPA mut導入HPDLにおいて、LIPA WT導入 HPDLと比較して、LALの酵素活性の有意な低下を認めた。LIPA WT、mut、及びEV導入HPDLを硬組織形成細胞へと分化誘導し、ALP活性を測定した結果、LIPA mutを導入したHPDLにおいて、LIPA WT導入HPDLと比較して、有意に低い ALP活性を認めた。また、アリザリンレッド染色の結果、LIPA mutを導入したHPDLにおいて、LIPA WT導入HPDLと比較して、有意に低い石灰化物形成能を認めた。さらに、Real-time PCR解析の結果、LIPA mutを導入したHPDLにおいて、LIPA WT導入HPDLと比較して、C0L1A1のmRNA発現の有意な低下を認めた。
【結論及び考察】
エクソームシークエンス解析の結果より得られたZM SNP rsl43793106のMAFを、日本人侵襲性歯周炎患者及び対照群間で比較したところ、P値は0. 037で、有意差を認めた。HPDLの硬組織形成細胞への分化に伴い、同細胞におけるLIPAのmRNA発現上昇を認めた。LIPA SNP rsl43793106のHPDLにおける機能解析の結果、LIPA SNP rsl43793106導入HPDLにおいて、LIPA WT導入HPDLと比較して、LALの酵素活性の低下、ALP活性の低下、石灰化物形成能の低 下、及び、C0L1A1 mRNA発現の有意な低下を認めた。HPDLの硬組織形成細胞への分化を負に制御することにより、侵襲性歯周炎の病態悪化に寄与することが示唆された。すなわち、LIPA SNP rsl43793106を日本人侵襲性歯周炎の疾患関連候補遺伝子として同定した。in vitro実験の結果、LIPA SNP rsl43793106はHPDLの硬組織形成細胞への分化を負に制御することにより、歯周組織に恒常性維持機構に変調をきたい侵襲性歯周炎の病態形成に関与するこ とが示唆された。本研究により同定されたLIPA SNP rsl43793016を、侵襲性歯周炎のリスク診断のマーカーとして利用することで、侵襲性歯周炎に対する早期診断及び予防的介入が可能となり、同疾患の発症の予防及び重症化阻止に貢献できると考えている。
