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固相表面培養を利用した微細藻類のCO2固定化技術開発

宮内 啓喜 東京薬科大学

2021.03.19

概要

<序論>
地球温暖化は、今日の大きな社会問題であり、その主要な原因の一つとして温室効果ガスの放出が考えられている。そのため、大気中の二酸化炭素(CO2)を削減する技術開発が進められている。光合成能をもつ微細藻類を用いた CO2 の吸収固定は CO2除去の最も有力な方法の一つとして提案されている。微細藻類が生産するバイオ燃料は、トウモロコシなどの農産物に由来するバイオ燃料と比べ食料品生産と競合する可能性が低く、新しい炭素循環をもたらす可能性が高いと期待されている。しかしながら、藻類を高濃度で液体培養することが困難なため、代替燃料として期待量に対し生産量が今のところ少なく、その生産性を上げることが重要である。

そこで、申請者らは、藻類の持つ付着性を利用した培養方法として「固相表面連続培養系 (Solid Surface Continuous Culture System)」(SSCC)を構築し、その改良を進めてきた。この技術は、布を細胞を保持する担体として使用し、上から培地を流し、布上に付着して増殖した細胞と流出した細胞を回収する培養方法である。本培養法は、固相と培地のプールが分離しているため細胞の回収コストが低く、培養装置内を水で満たす必要がなく、培養面が空気と接しているため産業排気による CO2 通気やそれによる加温が容易である。

本研究で扱う固相に付着した藻類の生理学的特徴の分析は、CO2 の固定化技術開発の上で重要である。一方、基礎研究としても自然界における付着藻の生理生態学研究という点で重要である。

本研究では、付着状態におけるクロレラ(Parachlorella kessleri)細胞の光合成特性を調べ、固相上環境への順応を調べることで細胞周囲の微小環境についても考察した。また、工場排水の利用の可能性を検討した。さらに、培養装置の大型化と培養条件の検討および様々な藻類種への適用の可能性を調べた。

<結果·考察>
第 1 章 固相表面上微細藻類細胞の CO2 固定の特性と固相表面の間隙構造の重要性
フィルターに P. kessleri を吸着させ、フィルターに乗せる細胞量と光合成速度の関係を求めたところ、細胞密度が 240 mg chl m-2以下では細胞密度と光合成速度がほぼ比例したが、それを超えると細胞を加えても全体の CO2 吸収速度はあまり増加しなかった。240 mg chl m-2以下での高 CO2 条件下のフィルター上でのクロロフィル(chl)あたりの光合成活性は、液相での測定結果と同程度で、90 μmol mg chl-1 h-1であった。フィルター上では気相にさらされるものの、細胞の周囲に少量の水があれば、光合成活性は十分に保持されることが明らかとなった。一方、低 CO2 条件下では固相上細胞の光合成活性は抑えられていた。

P. kessleri の固相上での光合成を弱光適応の高等植物葉の場合と比較すると光合成速度の 最大値は同等であったが、一般的に高等植物葉の細胞間 CO2 -光合成速度曲線が 400 μmol CO2 mol air-1で飽和していることを考慮すると、P. kessleri の細胞は密集して積み重なってい るためにより深い層への CO2 や光の供給が葉の場合よりも減少している可能性が考えられた。このように、固相表面上の細胞分布の検討による CO2 供給障壁の解消は、微細藻類バイオフ ィルム培養系における CO2 固定化時の光変換効率を高めるための最も重要なポイントの一つ であると考えられた。

培養技術の視点から固相上細胞の光合成速度を評価すると、倍加時間は 6.1 時間と求められた。これは、液体中の対数増殖期で測定された値とほぼ一致した。このことは、表層の細胞の周囲は光合成活性を維持するのに適した環境であり、細胞が高い炭素固定速度を維持していることを示唆している。また、固定された炭素は細胞内に貯蔵または細胞外に排出されることなく、ほとんどが細胞増殖に利用されていると考えられる。さらに、光-光合成曲線の初期勾配から要求光子数は約 18 と求められ、660 nm の赤色光のエネルギー(3×10-19 J photon-1)と P. kessleri の燃焼エネルギー(14–15 kJ g-1 DCW)から、光エネルギーは細胞によって 10–11%の効率で有機成分に変換されると推定された。さらに、上記の固相上細胞の光合成速度を用いて得られた値から、年間 110 t ha-1 で CO2 を固定できると推定される。

このように、固相上細胞は高速度かつ高効率で光合成による炭素固定が可能で、光合成による炭素固定化が技術的に社会的要求に応えられる可能性が示された。

第 2 章 微細藻類細胞の固相表面培養での環境応答
液体中で培養した細胞を固相に移して 12 時間後には、細胞あたりの chl 含有量および a/b比は減少したが、その後 24 時間までには回復した。12 時間での chl 含有量の減少から、培養開始直後の細胞が固相上の環境で強光や乾燥ストレスなどを受けて、活性中心や light harvesting complex (LHC)が分解されている可能性が考えられた。

そこで、PSⅡの電子伝達特性の経時的変化を PAM 蛍光法で調べたところ、PSⅡ最大量子収率はストレス応答の影響を受けておらず、PSⅡ複合体は損傷を受けていないことが示唆された。一方、光化学的消光は固相上に置かれた直後に減少していたが、12 時間までに回復していた。また、熱放散は 12 時間後まで高く、その後液体中と同程度まで低下していた。また、PSⅡの実効量子収率も固相培養に移すと低下し、その後 24 時間では回復していた。これらのことから、固相上の環境ストレスで PSⅡ自体はダメージを受けないが、下流の電子伝達が阻害されたため、余剰なエネルギーを熱として放散する応答が起きている可能性が考えられた。これに応じて PSⅡの実効量子収率が低下していることが示唆された。

固相表面上培養を液体培養と比較すると、照射光強度は同じでも、液体培養では細胞が攪 拌されるため他の細胞に被陰されて受ける光の強度が変動するのに対し、固相上の細胞はフ ィルター表面に固定されているため、表層の細胞は他の細胞に光を遮蔽されることがなく連 続して強光ストレスを受けていると考えられる。また、気相に面している固相表面からは水 分蒸発が多く、表層の細胞が乾燥ストレスを受けている可能性がある。一般的に、緑藻では 強光ストレスによって光化学系の分解、ステート遷移、キサントフィルサイクル、サイクリ ックな電子伝達が誘導され、光障害を軽減する応答が知られている。また、これらのストレ スで活性酸素種 (ROS)が産生され、それらは ROS 消去系によって消去されることが知られて いる。固相上の細胞ではサイクリックな電子伝達関連遺伝子の発現が上昇しており、これら の系が光化学系の損傷の抑制に寄与して環境ストレスに対し順応していることが考えられる。

第 3 章 固相表面に付着した微細藻類細胞による無機排水からのリンの取り込み特性
固相上の培養で、リン(P)を含んだ培地から P を取り除くことができた。さらに、固相に含ませる培地を P 欠乏培地にすることで P 飢餓応答を誘導し、細胞あたりの P 取り込み速度を高めることができた。次に、細胞密度が P の取り込みに及ぼす影響を調べた。細胞密度が 20g DCW m-2 以上の場合、固相表面積あたりの取り込み初速度は約 5.7 mg P m-2 min-1 であった。細胞密度に比例して P の取り込みが増えたが、細胞密度が 20 g DCW m-2を超えると増加は抑 えられ、細胞当たりの P 取り込み速度が減少することが示された。同様に、固体表面上の細 胞の光合成速度は、細胞密度が 20 g DCW m-2を超えると増加は抑えられたことから、細胞密 度の高い環境では細胞あたりの光合成速度や ATP 産生速度が低下し、リン酸(Pi)輸送体の機 能が抑制されたことが考えられる。固相に保持された液体の体積は約 1.5 L m-2であったので、 Pi 取り込み速度が飽和した固相表面の細胞密度は13g DCW L-1と計算される。このことから、 藻類付着培養系は、高い P 取り込み活性を維持しながら液体培養(0.5–6 g DCW L-1未満)より も高い細胞密度で細胞を培養できることが示され、固相表面積あたりの P 取り込み速度を液 体培養の池面積あたりの P 取り込み速度よりも高くできる可能性が示された。

実際の排水を用いたリン酸の除去系を確立するために、SSCC でエタノール製造工場由来の無機排水からの P 除去を試みたところ、24 時間の処理後、排水中の P 濃度は 3.5 mg L-1から0.07 mg L-1に減少し、固相表面上の細胞は排水中で増殖したことから、排水中でも液体培養の場合と同様に生育と同時に P を取り込むことができることが明らかになった。

この P. kessleri を利用した SSCC 型 P 除去システムを最適化して利用することで、閉鎖水域の P 濃度を環境基準値 (0.1 mg L-1)以下に低減させ、微細藻類のブルーミングを引き起こす水質汚濁を抑制することが期待できる。また、SSCC に富栄養化した水を使用することで、培養液のコスト削減にも貢献できることが示された。

第 4 章 固相表面上培養系の大型化及び藻類種の拡大による社会実装化への取り組み
これまで行なった小スケールでの結果が実用化の際の大スケールでも当てはまるか実証するために、比較的大きなスケール(80 cm×90 cm)での固相表面培養を行い、小スケールのものと比較したところ、研究室で通常培養実験で用いられる布面積 12.5 cm2の小型の培養装置と同等の収量となり、大型化することによる生育阻害は見られなかった。しかし、光合成速度から計算される細胞増殖速度約 19 g DCW m-2 day-1と比べて生育速度は低い値になった。実際の培養装置では細胞の密集により下層への光、CO2 、栄養の供給が十分ではないために細胞増殖速度が低く止まっている可能性が考えられた。

そこで、短時間での固相表面上での増殖を調べた。固相表面上では 1.3 g DCW m-1 h-1で増殖しており、4 時間で連続的に細胞を回収すると、24 時間あたりで 26 g DCW m-1 day-1以上の収量が得られ、固相上での細胞の増殖速度を上げる余地があることが示された。

本研究で示された SSCC の面積あたりの増殖速度は open pond と同等以上で、さらに装置の拡張が容易という利点を持つ。この培養方法で 1 m3の立方体に 33 枚の布を配置すれば、計算上ユニットとして設置面積あたりで 1 kg m-2 day-1の収量が得られることになる。さらにこのユニットを高さ 10 m×面積 100 m2の施設として設置すると、この施設あたり 1 ton day-1の乾燥細胞収量が得られ、1.8 ton day-1の CO2 が固定される計算になる。この施設を各都道府県に 500–1000 箇所、工場などの敷地に設置することで、3.3 千万ton (2019 年国内排出量の約 3%)を固定できると見積もることができる。

SSCC は、非常に多様な種での培養に利用できる可能性が示された。さらに、SSCC では、液体培養と比べ培地の交換による培養条件の変更が容易であり、細胞増殖と環境ストレス誘 導性の有用物質の蓄積という 2 つの異なる培養条件の組み合わせが容易になると考えられる。今後、SSCC での有用物質生産の可能性を検討していきたい。

本研究では、付着細胞が固相上の環境に順応し、高い生理活性を維持していることが示され、高いバイオマス生産性を示すことが明らかになった。それにより、固相表面培養系が微細藻類による CO2 固定及びバイオ燃料生産系として実用化に近づいたと考えられる。

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