ヒト気管支上皮細胞からのCCL20の放出におけるスフィンゴシン1リン酸/スフィンゴシン1リン酸3型受容体の役割

概要

スフィンゴシン 1 リン酸（S1P）は、増殖、移動、細胞骨格組織、接着結合の構築、形態形成などの多様な生物学的反応を調節する生物活性スフィンゴ脂質代謝物である。S1P は、 ATP 結合カセット型または他のトランスポーターによって細胞外に輸送され、細胞外 S1Pは、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達を介して S1P 受容体（S1PR）1〜5 として知られる 5 つの G タンパク質共役受容体に結合する。

S1PR にはさまざまな機能が知られている。免疫細胞機能における S1P と S1PR 間の相互作用の生理学的役割は、FTY720（スフィンゴシンキナーゼ 2（SPHK2）によって in vivoで生物学的に活性な FTY720-リン酸にリン酸化されるプロドラッグ）を使用して明らかにされている。FTY720-リン酸は S1PR2 を除く S1PR に結合し、S1PR1 のスーパーアゴニストとして作用するとともに、FTY720-リン酸は持続的な S1PR1 の内在化とリンパ球の隔離をもたらす。肺での FTY720 の働きは、肺樹状細胞の局所リンパ節への移動を阻害することにより喘息モデルにおける表現型を無効にする。VPC23019 は、S1PR1 と S1PR3 の両方で非選択的競合的拮抗薬として作用するアリールアミド含有 S1P 類似体で、これまでの研究で SPHK 阻害剤の投与が好酸球の炎症を予防することを示してきた。

最近、S1P が星状細胞のホスホリパーゼ Cε（PLCε）によって媒介されるシクロオキシゲナーゼ（COX）-2 などの炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘発することが示されている。また、これまでにPLCε は気管支上皮細胞で発現し、誘発期に気管支上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生をアップレギュレートすることにより喘息に関与することを示してきた。また、マウス気道上皮細胞で発現した S1PR2 が、気管支上皮細胞での核因子 κB（NF-κB）の活性化と CC ケモカインリガンド 3（CCL3）の産生に関与していることを発見した。ただし、S1PR2 拮抗薬である JTE013 は、オボアルブミン（OVA）誘発気道炎症を完全には軽減しなかった。

以上のようにS1PR2 は、肺の構造化細胞からのケモカイン産生を調節すると考えられた。今回、ヒト気管支上皮細胞ラインと実験的喘息マウスモデルを使用して、気道上皮細胞における S1P と S1PR3 の役割を評価することを目的とした。

気管支上皮細胞の喘息関連遺伝子発現における S1P の役割
気管支上皮細胞における遺伝子発現に対する S1P の効果を評価するために、気管支上皮細胞株（BEAS-2B、Calu-3）を用いてトランスクリプトーム解析を実施した。S1P 未処理気管支上皮細胞とは対照的に、S1P で処理した気管支上皮細胞は ADRB2 とPTGER4 を発現していた。S1P 処理群と未処理群を比較していずれの気管支上皮細胞株においても 4 倍以上にアップレギュレーションされたのは 14 遺伝子のみで、これらの遺伝子の中で CCL20は BEAS-2B において最もアップレギュレーションされた遺伝子であった。CCL20 を除いて、既報の喘息関連遺伝子で、両方の細胞株で 4 倍を超えるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示したものは認められなかった。CCL20 は、気管支上皮細胞から分泌され、喘息の 2 型ヘルパーT 細胞の応答に重要な樹状細胞の動員を調節すると報告されており、CCL20 の分泌は、酸化ストレス調節分子であるクラステリンによって調節されている。一般に、スフィンゴ脂質はクラステリンとは関係ないが、スフィンゴ脂質は上皮細胞からのサイトカインの産生に重要な役割を果たす。したがって、S1P が気管支上皮細胞からの CCL20 の産生を調節するかどうか、またどのように調節するかが重要な問題であると考えられた。

気管支上皮細胞からの CCL20 の放出におけるS1P / S1PR3 の役割
気管支上皮細胞株における S1PR の発現を qRT-PCR とウェスタンブロッティングによって解析し、S1PR3 の発現を確認した。siRNA を使用して S1PR3 遺伝子をノックダウンしたところ、S1P によって誘導される CCL20 の遺伝子発現が有意に抑制された（P <0.01〜 0.05）。 これらの結果は、S1P が S1PR3 を介して CCL20 発現を誘導したことを示唆するものと考えられた。

VPC23019 投与マウスの肺における好酸球性炎症の減弱
気管支喘息に対する CCL20 の役割を評価するために、OVA 誘発喘息マウスモデルを作成した。最後の OVA 投与の 24 時間後に、BAL 分析を実行し、抗 CCL20 抗体が OVA 誘発喘息マウスモデルで全体の好酸球の割合を 17％から 2％に減少させ、好酸球数を有意に減少させることを確認した（P <0.01）。この結果は、CCL20 が喘息マウスモデルにおいて重要な役割を果たしていることを示唆すると考えられた。喘息に対する VPC23019 の効果を評価するために、最後の OVA 投与の 24 時間後に気管支の組織学的分析を実施した。細気管支周辺の炎症細胞および PAS 染色陽性のムチン産生上皮細胞は、VPC23019 投与マウスで大幅に減少した。また、BAL においては VPC23019 を投与することで、全細胞および好酸球細胞の数が有意に減少した（P <0.05）。免疫染色を行ったところ、S1P によって誘導される CCL20 の発現が肺構造細胞において VPC23019 によって抑制されることを示した。一方、VPC23019 は、CCL3、TIMP2、および IL-8 の mRNA の発現は抑制しなかった。これらの結果は、VPC23019 が好酸球性炎症を軽減したことを示唆すると考えられた。

スフィンゴ脂質代謝物は、喘息の病因に関与しており、 S1P は、S1PR1 および S1PR3 を介して気道過敏性を促進し、肥満細胞、好酸球、樹状細胞などの免疫細胞を調節することが示されている。 今回我々は、気管支上皮細胞からの CCL20 の発現に対する S1P / S1PR3の役割を新たに明らかにし、気道好酸球性炎症に対する VPC23019 の治療効果を示した。

我々の研究はまた、S1P が気管支上皮細胞で ADRB2 と PTGER4 を誘発することを示し た。 β2-アドレナリン受容体遺伝子（ADRB2）は、気管支過敏性を含む気管支喘息のいくつかの臨床的特徴と相関している。ヒトと同様に、マウスの β2 アドレナリン受容体（β 2AR）サブタイプの分布は肺において不均一で、β2AR はマウスの気管上皮（71％）と気道平滑筋（ASM）（31％）で発現し、気管支平滑筋の β2AR はマウスの気管支拡張に重要な役割を果たしていると報告されている。さらに、気道上皮細胞における β2AR シグナル伝達が好酸球性炎症、粘膜化生、および気道収縮性を促進することが最近報告された。プロスタグランジン E4 受容体（PTGER4）の一塩基多型（SNP）は、喘息の症状に関連していると報告されている。プロスタグランジン E（PGE）受容体 4 は、肺を含むさまざまな組織で発現し、炎症と即時型過敏症に重要な役割を果たす。最近、S1P がシクロオキシゲナーゼ（COX）-2 を介した PGE2 産生を増加させることにより、ヒト ASM 細胞の β2 アドレナリン作動性活性を抑制することが報告されている。したがって、ADRB2 と PTGER4 は、 S1P 誘発性の実験的喘息マウスモデルに寄与する可能性がある。

今回の研究は、CCL20 に焦点を当てた。 CCL20、CCL19、および CCL27 を含む一連のケモカインは、主に微生物や刺激物などの刺激物に反応して気管支上皮細胞によって放出される。 これらのケモカインは、CCR6、CCR7、および CCR10 のリガンドを介して、上皮および下層の粘膜に向かって樹状細胞の移動を誘導する。 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、アレルギー性マウスの気道上皮細胞で豊富に発現しており、ケモカイン CCL20 の産生に関連している。 TRAIL の阻害は、CCR6 および CD4 を発現する骨髄性樹状細胞および T 細胞の気道へのホーミングを損ない、それによって TH2 細胞サイトカイン放出、炎症、気道過敏性および転写活性化因子 STAT6 の発現を含む気管支喘息のいくつかの表現型を抑制することが報告されている。 今回の実験結果は、CCL20 が喘息モデルにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。

結論として、喘息マウスモデルにおいて、S1P / S1PR3 経路は気管支上皮細胞からの CCL20 の放出に関わっている。 我々の結果は、S1P / S1PR3 が気管支喘息の治療の候補となる可能性があることを示唆している。