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Synthesis and Biological Applications of Phosphorescent Ir(III) Complex-based Probes with Arginine Peptide

安カ川, 真美 ヤスカガワ, マミ 群馬大学

2021.03.23

概要

近年、分子の発光を利用した生体関連物質のセンシング、イメージング技術は、生物学や医学の研究にとって欠かせないツールとなっている。この手法では、発光プローブと呼ばれる発光性分子の開発が重要である。これまでに開発されてきた発光プローブは、ほとんどが蛍光性分子を骨格とした蛍光プローブであった。一方、近年、蛍光に加えて、励起三重項状態からの発光であるりん光を利用したプローブが開発されつつある。りん光は、スピン禁制遷移であるため、蛍光に比べて励起寿命が長い。そのため、励起寿命内に拡散によって周囲の酸素分子との衝突が可能となり、酸素分子にエネルギーを渡して励起分子が失活するりん光消光が起こる。この酸素によるりん光消光反応を利用すると、生体内の酸素レベルをリアルタイムで検出することが可能になる。本博士論文では、室温下で強いりん光を示す Ir(Ⅲ)錯体に着目し、細胞内および in vivo で機能するりん光性プローブの開発を目指した。アルギニンペプチドを導入することで、高い細胞内移行性を有する Ir(Ⅲ)を合成し、それらを用いた細胞内酸素レベル計測を行った。また、アルギニンペプチドを結合させた Ir(Ⅲ)錯体が血管内皮に止まることを発見し、in vivo 血管イメージングプローブへの応用を行った。

第１章では、序論として、りん光性金属錯体を用いた酸素濃度計測法の概要と、これまでに開発されたりん光性プローブの課題点、本研究の目的について述べた。

第２章では、プローブの細胞内移行性を向上させるためにアルギニンペプチドを導入した Ir(Ⅲ)錯体を合成し、細胞内酸素プローブへの応用を行った。本研究で開発した酸素プローブは、酸素感受性を示すりん光団と、酸素感受性をほとんど示さない蛍光団から構成される。蛍光とりん光の 2 波長の強度比（レシオ）を測定することで酸素濃度の定量が可能となる。しかし、このような蛍光とりん光の強度比を利用したレシオ型酸素プローブの開発は非常に遅れており、これまでに報告されているプローブは、細胞移行性が低く、細胞内での定量的な解析が困難であった。そこで、細胞移行性を向上させるため、膜透過性ペプチドであるオリゴアルギニンをリンカーとして、青色蛍光性クマリンと赤色りん光性イリジウム錯体を結合したレシオ型酸素プローブ 7DEAC-R8-BTQphen(R8) および 7DEAC-R12-BTQphen(R12)を開発した。まず、合成したプローブについて、溶液中、脂質膜中における光物理特性の解明を行った。次に、レシオプローブ R8、R12 の細胞移行性を評価するため、既存のプローブ C343-P8-BTQphen(P8)との比較を行った。培養細胞中での各プローブの発光強度を測定したところ、R8 および R12 は、P8 に対し、著しく高い発光強度を示したため、アルギニンペプチドを導入することで細胞移行性が飛躍的に向上したことが明らかとなった。また、開発したレシオ酸素プローブを用いて細胞内の酸素濃度勾配をイメージングすることに成功した。

第３章では、アルギニンペプチドを結合させた Ir(Ⅲ)錯体が血管内皮に止まることを発見し、in vivo 血管イメージングプローブへの応用を行った。Ir(Ⅲ)錯体 BTQphen の配位子に異なる長さのアルギニンペプチドを結合させた BTQ-Rn (n = 4, 8, 12, 16)を合成し、血管イメージングプローブとしての有用性を明らかにした。BTQ-Rn および市販の緑色蛍光性血管内皮染色試薬である FITC-トマトレクチンをマウスに投与した後、共焦点顕微鏡を用いて腎臓の毛細血管のイメージングを行った。BTQphen および BTQ-R4 では，尿細管細胞から発光が観測されたのに対して、BTQ-R8、BTQ-R12、BTQ-R16 では、FITC-レクチンと同様に腎臓の毛細血管がイメージングされた。よって、血管イメージングには、8 残基以上のアルギニンペプチドを結合させた Ir(Ⅲ)錯体が有効であると明らかになった。また、腎臓は強い自家蛍光を示す組織であるが、時間分解測定により蛍光が減衰する程度の時間をおいてから、プローブからのりん光のみを観測することで、自家蛍光を排除し、より鮮明に血管内皮をイメージングできることを明らかにした。さらに、担がんマウスおよび脂肪肝モデルマウスを作製し、病態組織における血管イメージングを試みた。BTQ-R12 を担がんマウスに投与した後、腫瘍組織を観察したところ、不規則な血管走行や、既存の血管から伸長した新生血管など、腫瘍血管に特徴的な血管構造を可視化することができた。また、脂肪肝モデルマウスでは、BTQ-R12 および蛍光性脂質滴染色試薬をマウスに同時投与し、血管と脂質滴を多色イメージングした。正常な肝臓では、類洞血管が肝細胞の間を直線的に走行している様子が観察された。一方、脂肪肝では、大きな脂質滴の形成に伴い、類洞血管が大きく蛇行している様子や、狭小化している様子が観察された。従って、病態の進行に伴って血管構造が変化、破綻する様子を可視化することに成功した。

第４章では、本学位論文を総括し、今後の展望について述べた。第２章において、アルギニンペプチドを導入したレシオ型酸素プローブを設計・開発し、これまでのレシオ型プローブでは測定困難であった細胞内の酸素レベルを定量的にイメージングすることに成功した。発光強度比を測定することで、簡便に細胞内の酸素レベルを測定することができるため、生化学や創薬など様々な研究分野への応用が期待される。また、これまでアルギニンペプチドの in vivo における挙動は、詳細に解明されていなかったが、第３章において、アルギニンペプチドを結合させた Ir(Ⅲ)錯体が血管内皮に止まることを明らかにした。開発した Ir(Ⅲ)錯体は、様々な臓器や病態組織において使用可能であり、組織内の血管構造を調べるためのイメージングプローブとして有用であると考えられる。

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