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High-resolution O2 imaging of living tissues based on phosphorescence lifetime imaging microscopy using Ir(III) complexes

水上, 輝市 ミズカミ, キイチ 群馬大学

2021.03.23

概要

酸素は好気性生物の代謝過程において必要不可欠な分子であり、生体内において細胞の分化や増殖、代謝さらには細胞間情報伝達など様々な生命活動に関与している。生体組織内の酸素濃度変化は様々な病気の発症や増悪、進行に深く関わっており、組織中の酸素化状態を高分解能でライブイメージングする技術は、低酸素が関係する病態の発症・進展機序の解明、低酸素に対する応答機構の解明などに大きく貢献することが期待できる。生体組織における酸素濃度の測定には、酸素濃度に依存して発光特性が変化するりん光に基づいた光学的測定法が有用である。本研究では、室温で強いりん光を発するイリジウム(Ir)錯体を酸素プローブとして開発し、共焦点りん光寿命イメージング顕微鏡（PLIM）法を用いて、細胞スフェロイドや生体組織の酸素濃度分布を高分解能で画像化する技術を開発した。本研究で構築した共焦点 PLIM システムは倒立顕微鏡と共焦点レーザースキャニングシステムで構成されており、Ir 錯体を酸素プローブとして用いることで細胞や組織の高分解能酸素イメージングが可能である。

第 1 章では、序論として本研究の背景、これまでに報告されている酸素濃度測定法の概要、本研究の目的について、第 2 章では実験手法について述べられている。

第 3 章では、溶液中における Ir 錯体の光物理特性、細胞内特性を明らかにし、細胞内酸素プローブとしての評価を行った。続いて細胞スフェロイドの酸素分圧分布の可視化を試みた。本研究で用いた Ir 錯体 BTPDM1 と BTP-3OH は発光輝度やりん光寿命の長さ、酸素感受性などの光物理特性において細胞内酸素プローブとして優れた特性を示し、高い細胞内移行性や光安定性、低い細胞毒性を有していることが明らかになった。細胞スフェロイドの培養液にこのプローブを最終濃度 500 nM になるよう添加し 24 時間培養したところ、 HT-29 細胞スフェロイド全体にプローブが行き渡り、細胞スフェロイドの酸素イメージングを可能にした。PLIM 測定の結果から、HT-29 細胞スフェロイドは表面から内部に向かってりん光寿命が長くなっていることがわかった。HT-29 細胞を用いたりん光寿命の校正に基づいてりん光寿命から酸素分圧を算出すると、内部になるほど低酸素状態に陥っていることが明らかになった。これは、細胞スフェロイドの表面側の細胞の酸素消費によって、細胞スフェロイドの内部への酸素供給が不十分となるためである。さらに、細胞内のミトコンドリアのプロトン濃度勾配を解消する脱共役剤である FCCP および呼吸阻害剤 antimycin A を HT-29 細胞スフェロイドに添加し、酸素分圧の経時変化をリアルタイム計測することに成功した。これらの結果は、本法を用いることで酸素消費が関与する生体内の代謝過程を、時空間的に追跡できることを示している。

第 4 章では肝臓の酸素イメージングについて検討した。BTPDM1 あるいは BTP-3OH をマウスに投与した後に肝臓表層の PLIM 測定を行ったところ、肝小葉内の門脈から中心静脈に向かってりん光寿命が長くなった。これは血流に沿って肝細胞が酸素を消費するためである。AML12 細胞を用いてりん光寿命の酸素分圧に対する calibration を行いそれぞれのプローブから得られたりん光寿命から酸素分圧を算出した。BTPDM1 によって求められた酸素分圧は、門脈付近が 39 mmHg、中心静脈付近が 24 mmHg となった。一方、BTP-3OH によって求められた酸素分圧は、門脈付近が 7 mmHg、中心静脈付近が 3 mmHg となり、BTPDM1 と比較して著しく低い値を与えた。これは肝臓における毒物や異物の代謝による酸素消費のためと考えられ、肝臓における解毒の際の酸素消費変化を観察するため、塩化アンモニウムを投与し、肝臓の酸素濃度の経時変化を PLIM 法によって調べた。BTPDM1 を投与したマウスに、さらに塩化アンモニウムを投与し肝臓の PLIM 画像を測定したところ、10 分以内に BTPDM1 のりん光寿命が著しく増加し、酸素分圧が低下していることがわかった。その後、数十分で正常状態の酸素レベルに回復した。塩化アンモニウムの投与によって肝臓が低酸素状態に陥った理由は、アンモニアの解毒経路であるオルニチン回路が働き、酸素を消費する ATP 産生が活性化したためと考えられる。このように、Ir 錯体を酸素プローブとした PLIM 測定によって、生きたマウスにおける肝組織の酸素レベルの変化を高分解能でイメージングできることが明らかになった。

第 5 章では、腎臓の酸素イメージングについて検討した。血管内皮細胞を染色する蛍光プローブ FITC-lectin と酸素プローブとして BTPDM1 をマウスに投与した後、開腹し腎臓を露出させ in vivo FLIM/PLIM 測定を行った。蛍光寿命イメージング（FLIM）測定を行った結果、腎表層の尿細管細胞とその周辺組織の形態や毛細血管を観測することができた。また、PLIM 測定を行った結果、BTPDM1 は血管壁を透過し、腎臓の尿細管細胞に集積して酸素濃度に依存したりん光寿命を与えていることがわかった。腎臓の近位尿細管は主に糸球体に近い S1 セグメントとその下流に位置する S2 セグメントで構成され、それらのセグメント間で異なる酸素レベルを有していることが PLIM 測定によって明らかになった。さらに、窒素/酸素混合ガスを用いて、マウスの吸気酸素分圧を 21%から 15%に低下させたところ、尿細管内の BTPDM1 のりん光寿命が長くなり、21%に戻すと再びりん光寿命が短くなった。HK-2 細胞を用いた calibration 実験に基づいてりん光寿命を酸素分圧に変換したところ、得られた酸素分圧は従来法である酸素電極を用いて測定した報告と一致しており、本研究で開発した共焦点 PLIM システムを用いることによって、腎組織の酸素化状態を高空間分解能でイメージングできることが明らかになった。

最後に、第 6 章で本研究の総括と今後の展望について述べられている。

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