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Improved methods for the differentiation of hypothalamic vasopressin neurons using mouse induced pluripotent stem cells

Mitsumoto, Kazuki 光本, 一樹 名古屋大学

2020.04.02

概要

【緒言】
　視床下部は、身体機能の恒常性調節に必要不可欠である。視床下部ニューロンを用いる研究は、十分な数の細胞を確保しつつ機能を維持する点で技術的な問題があった。解決策の1つとして、胚性幹（ES）細胞や人工多能性幹（iPS）細胞など、多能性幹細胞の利用が挙げられる。
　胚発生中の臓器形成は複雑なプロセスで構成されるが、これをin vitroでモデル化することを可能としてきた。我々の同僚はこれまでに、ES細胞の三次元培養法による神経分化法を確立し、serum-free culture of embryoid body-like aggregates with quick reaggregation（SFEBq）と呼ばれている。SFEBqを使用して、我々と同僚は、マウスおよびヒトES細胞からのバソプレシン陽性ニューロンなどの視床下部ニューロンの分化培養法を開発し、これらの系を利用した分析用のin vitroモデルを開発した。これらの視床下部誘導法は、胚発生において視床下部が神経板の最も吻側部に由来するという原理に基づいている。最吻側を実現するために、培養初期分化段階で外因性パターン化因子を厳密に除去した培地（gfCDM）を用いることが吻側視床下部様前駆細胞の形成に重要である。我々の培養方法は、分化細胞からバソプレシン（AVP）分泌を達成した、すなわち機能的な視床下部ニューロンを分化出来る唯一の技術である。
　視床下部モデルとして利用するために、機能性の再現に加えてもう一つ重要なのが、分化効率である。我々の方法は、既報と比較して高いAVPニューロンへの分化効率を達成していた。しかし、誘導細胞をin vitroモデルとして簡便に使用できるようにするには、更に効率を高めるための技術的な改善が必要であった。
　本研究では、マウスiPS細胞から視床下部AVPニューロンへの分化誘導効率を改善させることを目的とした。

【対象および方法】
　C57BL/6Jマウス胎児（E12.5）の線維芽細胞よりマウスiPS細胞株を樹立した。液体窒素で凍結保存中のマウスiPS細胞を解凍し、マイトマイシンC処理したmouse embryonic fibroblast(MEF)をフィーダー細胞として、Leukemia Inhibitory Factor(LIF)およびY27632を含む培地にて培養した。翌日、Y27632を含まない維持培地に交換した。マウスiPS細胞のコロニーをトリプシン-EDTA処理で剥離し、ピペッティングにて単一細胞に分離、PBSにて洗浄後、非コーティングディッシュ上のY27632を含む維持培地に懸濁した。マウスiPS細胞は4日後には浮遊凝集体を形成した。これら浮遊凝集体を回収、再びトリプシン-EDTA処理することで解離した単一細胞を新たな維持培地に懸濁した。これらの継代手順を4日ごとに繰り返した。
　形成した浮遊凝集体を凍結保存液CELLBANKER1にて凍結し、液体窒素で気相保存した。4日後、それらを解凍、継代し、新たに形成された浮遊凝集体を免疫組織化学的に評価した（Fig1D, E）。
　上記方法にて未分化維持されたマウスiPS細胞による浮遊凝集体を、トリプシン-EDTA処理で単一細胞に解離し、Y27632を含むgfCDM培地へ懸濁後に96ウェルプレートへ播種した。5％CO2、37°Cの培養下で細胞は自律的かつ迅速に凝集した。7日後に、マウスFibroblast growth factors (Fgf)8bおよび未分画ヘパリンをgfCDM培地に添加し、10日後に培地の半分をFgf8b、未分画ヘパリン、CNTFを含むDFNB培地(DMEM high glucose: F12 mixed 1:1, with N2 and B27)に置換した。
　13日後、凝集体をTranswell培養プレートに移し、底部ウェルをFgf8bおよびヘパリン添加DFNB培地で満たした。以降、培地は1日おきに交換した。26日後以降、培地交換の頻度は毎日とした。分化誘導したAVPニューロンを免疫組織化学、FACS、RT-PCR、KCL刺激によるAVP分泌試験により評価した。

【結果】
　一般に、マウスES/iPS細胞の維持培養では、MEFの代わりにゼラチンまたはマトリゲルが頻用されている。ゼラチンコーティングを使用した従来の接着培養では、未分化細胞コロニーの周囲に神経およびグリア細胞へ分化したと考えられる細胞が多数観察された（Fig1. B）。ゼラチンコーティングされたディッシュと比較して、MEFコーティングされたディッシュ（Fig1. A）では、特徴的な丸いドーム状の形状を示す多くのコロニーが形成された。しかし、ES/iPS細胞由来の分化組織をin vitroモデルとして使用する場合、MEFの混入は望ましくない。そのため、初回の継代後はMEFを使用せず、代わりに新しい継代方法を開発した（Fig1. B）。新しい浮遊培養法では、細胞塊の大部分が未分化細胞で構成されていた（Fig1. B, C）。少数の分化した細胞は培養ディッシュの表面に付着しているため（Fig1. B）、これらの分化した細胞が次継代へ混入することを避けることが可能である。免疫組織化学染色では、Method2の浮遊培養法が、未分化状態を維持するのに最も適していることが示された（Fig1. C）。未分化マーカーの発現は、凍結保存し解凍した(Fig1. D.)後も維持された（Fig1. E）。
　分化誘導法の改善については、ひとつはY-27632を分化誘導初期に添加することである。Y-27632添加によりiPS凝集体の成長が促進された(Fig. 2. A., Fig. 3.)。もうひとつは、分化誘導後期にFgf8bとヘパリンで処理することである。Fgf8bとヘパリン添加により、AVP前駆体マーカーであるOrthopedia homeobox(Otp)とPOU Class 3 Homeobox 2(Pou3f2)の発現が増加し(Fig. 2. B)、AVPニューロンの陽性率が増加した(Fig. 2. B)。Fig2に示すようにAVP陽性細胞は、従来の方法では散発性に認めたが、Fgfb8およびヘパリン処理によりAVP陽性細胞が神経核様に集蔟した(Fig. 2. B)。KCl刺激によるAVP分泌は、Fgf8bおよびヘパリン処理した群でより分泌量が多かった（Fig2. C）。免疫組織化学およびRT-PCRにより、分化したAVPニューロンおよび他の視床下部ニューロンが以前の報告と類似していることも示された。

【考察】
　ES細胞およびiPS細胞は、再生医療、発生学的な基礎研究、および疾患研究に利用できるため、分化方法の確立は重要である。これまで、いくつかの報告で、視床下部ニューロンの多能性幹細胞からの分化が示されていた。本研究では、AVPニューロン分化効率を上昇させる2つの重要なポイントを見出した。
　第一の改善点は、未分化状態の維持を従来の方法よりも効率的にしたことである。On MEF培養と浮遊球培養を組み合わせ、マウスiPS細胞の未分化状態維持と増殖能を改善した。LIFはマウス多能性幹細胞の未分化性維持に不可欠であるが、十分ではない。本研究では、未分化状態を維持するのが比較的困難な性質を持つマウスiPS細胞株を用いた。以前の報告では、MEFがアクチビンAとTGFβ1を分泌することが示されている。他の報告では、アクチビン-Nodal-TGFβシグナル伝達の内因的に活性化されたオートクリンループがES細胞の自己複製を促進することが示されている。以上の理由で、解凍直後にはMEFを利用することにした。その後の維持培養には、MEFの混入を避ける目的で、浮遊培養にて凝集塊を形成させる方法を採用した。凍結融解作業を経た後でも未分化状態を維持することが可能であることから、将来的に大量培養を容易にする可能性がある。
　第二点として、分化手順の改善を行った。従来法では、胚の視床下部部位発生を再現することに焦点を合わせ、初期胚発生時の神経板の最も吻側部分を目標に最小限の位置情報を含む培地を使用した。本研究では、まだ考慮されていない視床下部分化誘導の後期に焦点を当てた。AVPの分化に直接関連している転写因子がOtp、Single-minded homolog 1(Sim1)、Pou3f2であること、Fgf8が視索上核（SON）においてOtp発現を増加させるために必要であること、さらに、Fgf8-hypomorphicマウスにおいてAVPニューロンの低下を認めたとの報告がある。Fgf8bを用い、その添加時期と濃度を最適化して、Otp陽性細胞とAVPニューロンの数を増加させた。Fgf8とFGFR1の発現パターンはヒトで保存されていることが報告されており、Fgf8シグナル伝達は視床下部下垂体軸の発達に重要であることから、今後、ヒトiPS細胞の培養に適用できると期待される。また、疾患特異的iPS細胞を使用して、遺伝子変異によって引き起こされる神経変性難病である家族性中枢性尿崩症などの疾患モデルを確立することも期待される。

【結語】
　浮遊培養法による未分化維持培養法の改良とFgf8bによるOtpの誘導効率向上によりAVPニューロンへの効率的な分化誘導法の確立に成功した。

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Alvarez-Bolado, G., 2019. Development of neuroendocrine neurons in the mammalian hypothalamus. Cell Tissue Res. 375, 23–39. https://doi.org/10.1007/s00441-018- 2859-1.

Arima, H., Azuma, Y., Morishita, Y., Hagiwara, D., 2016. Central diabetes insipidus. Nagoya J. Med. Sci. 78, 349–357. https://doi.org/10.18999/nagjms.78.4.349.

Azuma, Y., Hagiwara, D., Lu, W., Morishita, Y., Suga, H., Goto, M., Banno, R., Sugimura, Y., Oyadomari, S., Mori, K., Shiota, A., Asai, N., Takahashi, M., Oiso, Y., Arima, H., 2014. Activating transcription factor 6α is required for the vasopressin neuron system to maintain water balance under dehydration in male mice. Endocrinology 155, 4905–4914. https://doi.org/10.1210/en.2014-1522.

Bedont, J.L., Newman, E.A., Blackshaw, S., 2015. Patterning, specification, and differ- entiation in the developing hypothalamus. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 4, 445–468. https://doi.org/10.1002/wdev.187.

Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J.L., 2005. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222–230. https://doi.org/10.1159/000088977.

Caqueret, A., Boucher, F., Michaud, J.L., 2006. Laminar organization of the early de- veloping anterior hypothalamus. Dev. Biol. 298, 95–106. https://doi.org/10.1016/j. ydbio.2006.06.019.

Del Giacco, L., Pistocchi, A., Cotelli, F., Fortunato, A.E., Sordino, P., 2008. A peek inside the neurosecretory brain through orthopedia lenses. Dev. Dyn. 237, 2295–2303. https://doi.org/10.1002/dvdy.21668.

Duplan, S.M., Boucher, F., Alexandrov, L., Michaud, J.L., 2009. Impact of Sim1 gene dosage on the development of the paraventricular and supraoptic nuclei of the hy- pothalamus. Eur. J. Neurosci. 30, 2239–2249. https://doi.org/10.1111/j.1460-9568. 2009.07028.x.

Eiraku, M., Watanabe, K., Matsuo-Takasaki, M., Kawada, M., Yonemura, S., Matsumura, M., Wataya, T., Nishiyama, A., Muguruma, K., Sasai, Y., 2008. Self-organized for- mation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell 3, 519–532. https://doi.org/10.1016/j.stem.2008.09.002.

Eiselleova, L., Peterkova, I., Neradil, J., Slaninova, I.V.A., Hampl, A., Dvorak, P., 2008. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Dev. Biol. 52, 353–363. https://doi.org/10.1387/ijdb.082590le.

Hagiwara, D., Arima, H., Morishita, Y., Wenjun, L., Azuma, Y., Ito, Y., Suga, H., Goto, M., Banno, R., Sugimura, Y., Shiota, A., Asai, N., Takahashi, M., Oiso, Y., 2014. Arginine vasopressin neuronal loss results from autophagy-associated cell death in a mouse model for familial neurohypophysial diabetes insipidus. Cell Death Dis. 5, e1148–e1149. https://doi.org/10.1038/cddis.2014.124.

Hagiwara, D., Grinevich, V., Arima, H., 2019. A novel mechanism of autophagy-asso- ciated cell death of vasopressin neurons in familial neurohypophysial diabetes in- sipidus. Cell Tissue Res. 375, 259–266. https://doi.org/10.1007/s00441-018-2872-4.

Hayashi, M., Arima, H., Ozaki, N., Morishita, Y., Hiroi, M., Ozaki, N., Nagasaki, H., Kinoshita, N., Ueda, M., Shiota, A., Oiso, Y., 2009. Progressive polyuria without vasopressin neuron loss in a mouse model for familial neurohypophysial diabetes insipidus. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. 296, 1641–1649. https://doi.org/10. 1152/ajpregu.00034.2009.

Johansson, B.M., Wiles, M.V., 1995. Evidence for involvement of activin A and bone morphogenetic protein 4 in mammalian mesoderm and hematopoietic development. Mol. Cell. Biol. 15, 141–151.

Lu, F., Kar, D., Gruenig, N., Zhang, Z.W., Cousins, N., Rodgers, H.M., Swindell, E.C., Jamrich, M., Schuurmans, C., Mathers, P.H., Kurrasch, D.M., 2013. Rax Is a Selector Gene for Mediobasal Hypothalamic Cell Types. 33. pp. 259–272. https://doi.org/10. 1523/JNEUROSCI.0913-12.2013.

Lund, C., Pulli, K., Yellapragada, V., Giacobini, P., Lundin, K., Vuoristo, S., Tuuri, T., Noisa, P., Raivio, T., 2016. Development of gonadotropin-releasing hormone-se- creting neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 7, 149–157. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2016.06.007.

McCabe, M.J., Gaston-Massuet, C., Tziaferi, V., Gregory, L.C., Alatzoglou, K.S., Signore, M., Puelles, E., Gerrelli, D., Farooqi, I.S., Raza, J., Walker, J., Kavanaugh, S.I., Tsai, P.S., Pitteloud, N., Martinez-Barbera, J.P., Dattani, M.T., 2011. Novel FGF8 mutations associated with recessive holoprosencephaly, craniofacial defects, and hypothalamo- pituitary dysfunction. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96, E1709–E1718. https://doi.org/ 10.1210/jc.2011-0454.

Merkle, F.T., Maroof, A., Wataya, T., Sasai, Y., Studer, L., Eggan, K., Schier, A.F., 2015. Generation of neuropeptidergic hypothalamic neurons from human pluripotent stem cells. Development 142, 633–643. https://doi.org/10.1242/dev.117978.

Michaud, J.L., Rosenquist, T., May, N.R., Fan, C.M., 1998. Development of neuroendo- crine lineages requires the bHLH-PAS transcription factor SIM1. Genes Dev. 12, 3264–3275. https://doi.org/10.1101/gad.12.20.3264.

Morishita, Y., Arima, H., Hiroi, M., Hayashi, M., Hagiwara, D., Asai, N., Ozaki, N., Sugimura, Y., Nagasaki, H., Shiota, A., Takahashi, M., Oiso, Y., 2011. Poly(A) tail length of neurohypophysial hormones is shortened under endoplasmic reticulum stress. Endocrinology 152, 4846–4855. https://doi.org/10.1210/en.2011-1415.

Nakai, S., Kawano, H., Yudate, T., Nishi, M., Kuno, J., Nagata, A., Jishage, K.I., Hamada, H., Fujii, H., Kawamura, K., Shiba, K., Noda, T., 1995. The POU domain transcription factor Brn-2 is required for the determination of specific neuronal lineages in the hypothalamus of the mouse. Genes Dev. 9, 3109–3121. https://doi.org/10.1101/gad. 9.24.3109.

Niwa, H., Ogawa, K., Shimosato, D., Adachi, K., 2009. A parallel circuit of LIF signalling pathways maintains pluripotency of mouse ES cells. Nature 460, 118–122. https:// doi.org/10.1038/nature08113.

Ogawa, K., Saito, A., Matsui, H., Suzuki, H., Ohtsuka, S., Shimosato, D., Morishita, Y., Watabe, T., Niwa, H., Miyazono, K., 2007. Activin-Nodal signaling is involved in propagation of mouse embryonic stem cells. J. Cell Sci. 120, 55–65. https://doi.org/ 10.1242/jcs.03296.

Ogawa, K., Suga, H., Ozone, C., Sakakibara, M., Yamada, T., Kano, M., Mitsumoto, K., Kasai, T., Kodani, Y., Nagasaki, H., Yamamoto, N., Hagiwara, D., Goto, M., Banno, R., Sugimura, Y., Arima, H., 2018. Vasopressin-secreting neurons derived from human embryonic stem cells through specific induction of dorsal hypothalamic progenitors. Sci. Rep. 8, 3615. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22053-x.

Orquera, D.P., Low, M.J., Rubinstein, M., De Souza, F.S.J., 2016. Essential function of the transcription factor Rax in the early patterning of the mammalian hypothalamus. Dev. Biol. 416, 212–224. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.05.021.

Qin, C., Li, J., Tang, K., 2018. The paraventricular nucleus of the hypothalamus: devel- opment, function, and human diseases. Endocrinology 159, 3458–3472. https://doi. org/10.1210/en.2018-00453.

Simeone, A., D’Apice, M.R., Nigro, V., Casanova, J., Graziani, F., Acampora, D., Avantaggiato, V., 1994. Orthopedia, a novel homeobox-containing gene expressed in the developing CNS of both mouse and drosophila. Neuron 13, 83–101. https://doi. org/10.1016/0896-6273(94)90461-8.

Takahashi, K., Yamanaka, S., 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse em- bryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663–676. https:// doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024.

Takeuchi, S., Iwama, S., Takagi, H., Kiyota, A., Nakashima, K., Izumida, H., Fujisawa, H., Iwata, N., Suga, H., Watanabe, T., Kaibuchi, K., Oiso, Y., Arima, H., Sugimura, Y., 2016. Tomosyn negatively regulates arginine vasopressin secretion in embryonic stem cell-derived neurons. PLoS One 11, 1–21. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0164544.

Tochiya, M., Hagiwara, D., Azuma, Y., Miyata, T., Morishita, Y., Suga, H., Onoue, T., Tsunekawa, T., Takagi, H., Ito, Y., Iwama, S., Goto, M., Banno, R., Arima, H., 2018. Chemical chaperone 4-phenylbutylate reduces mutant protein accumulation in the endoplasmic reticulum of arginine vasopressin neurons in a mouse model for familial neurohypophysial diabetes insipidus. Neurosci. Lett. 682, 50–55. https://doi.org/10. 1016/j.neulet.2018.06.013.

Tsai, P., Brooks, L.R., Rochester, J.R., Kavanaugh, S.I., Chung, W.C.J., 2011. Fibroblast growth factor signaling in the developing neuroendocrine hypothalamus. Front. Neuroendocrinol. 32, 95–107. https://doi.org/10.1016/j.yfrne.2010.11.002.

Wang, W., Lufkin, T., 2000. The murine Otp homeobox gene plays an essential role in the specification of neuronal cell lineages in the developing hypothalamus. Dev. Biol. 227 (227), 432–449. https://doi.org/10.1006/dbio.2000.9902.

Wang, L., Meece, K., Williams, D.J., Lo, K.A., Zimmer, M., Heinrich, G., Carli, J.M., Leduc, C.A., Sun, L., Zeltser, L.M., Freeby, M., Goland, R., Tsang, S.H., Wardlaw, S.L., Egli, D., Leibel, R.L., 2015. Behavior of traditional timber frames under reverse- cyclic loading. J. Clin. Invest. 125, 796–808. https://doi.org/10.1172/JCI79220DS1.

Watanabe, K., Kamiya, D., Nishiyama, A., Katayama, T., Nozaki, S., Kawasaki, H., Watanabe, Y., Mizuseki, K., Sasai, Y., 2005. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288–296. https://doi.org/10. 1038/nn1402.

Wataya, T., Ando, S., Muguruma, K., Ikeda, H., Watanabe, K., Eiraku, M., Kawada, M., Takahashi, J., Hashimoto, N., Sasai, Y., 2008. Minimization of exogenous signals in ES cell culture induces rostral hypothalamic differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 11796–11801. https://doi.org/10.1073/pnas.0803078105.

Xie, Y., Dorsky, R.I., 2017. Development of the hypothalamus: conservation, modification and innovation. Development 144, 1588–1599. https://doi.org/10.1242/dev. 139055.

Ying, Q., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A., 2008. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519–523. https://doi.org/10.1038/nature06968.

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