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Differentiation of human induced pluripotent stem cells into hypothalamic vasopressin neurons with minimal exogenous signals and partial conversion to the naive state

尾崎, 創 名古屋大学

2023.05.30

概要

主論文の要旨

Differentiation of human induced pluripotent stem
cells into hypothalamic vasopressin neurons with
minimal exogenous signals and partial conversion to
the naive state
部分的なナイーブ化および外因性シグナルの
最小化によるヒト人工多能性幹細胞からの
視床下部バソプレシンニューロンの分化

名古屋大学大学院医学系研究科
病態内科学講座

総合医学専攻

糖尿病・内分泌内科学分野

(指導:有馬 寛
尾崎 創

教授)

【緒言】
家族性中枢性尿崩症(FNDI)は、視床下部アルギニン・バソプレシン(AVP)ニューロ
ンの変性により、AVP 分泌の進行性の低下を特徴とし、その原因となる遺伝子変異の
多くは AVP の輸送蛋白であるニューロフィジン II(NPII)をコードする領域に見られ
る。実際の AVP 患者で報告されている Cys98Stop 変異を持つ FNDI マウスを用いた解
析により、変異タンパク質が小胞体(ER)に蓄積することで生じる ER ストレスが FNDI
の病態と関連している可能性が示唆された。FNDI の病態の全容を解明するためには、
ヒトモデルを用いた更なる研究が必要であるが、生きているヒトに対しては視床下部
生検が不可能であるため、ヒトの FNDI 患者における AVP ニューロンの病理報告は剖
検研究に限られているなど、ヒトでの FNDI 研究は技術的に困難である。したがって、
ヒト FNDI 特異的な人工多能性幹細胞(iPS 細胞)から AVP ニューロンを分化誘導でき
れば、病態解析や薬剤開発のための有望なヒトモデルとなる。
培地に位置情報を制御する因子を添加することにより、多能性幹細胞から様々な組
織への分化が報告されてきた。胚の視床下部は、神経板の最吻側部に由来し、マウス
胚性幹細胞(ES 細胞)から視床下部を分化させるためには、分化初期に外因性シグナル
を厳密に除去し、最吻側へと位置情報を制御することが重要であった。growth factorfree chemically defined medium(gfCDM)と呼ばれる外因性シグナルを最小限に抑えた培
地により、マウス ES/iPS 細胞は AVP ニューロンを含む吻側視床下部へ分化した。
しかし、ヒト ES 細胞は gfCDM を用いた外因性シグナルが最小限の条件下では、数
日しか生存できなかった。細胞の生存のため血清代替物(KSR)の添加が必要となった
が、KSR に含まれる位置情報により、分化位置が尾側、背側にシフトし、終脳前駆細
胞へと分化しまうため、第 2 段階として吻側化、腹側化のシグナルを加えて強制的に
視床下部へ位置を変更させる必要が生じた。この 2 段階の分化戦略では、視床下部へ
の分化効率が悪くなると推測される。したがって、本研究ではヒト ES/iPS 細胞とマウ
ス ES/iPS 細胞の違いに着目し、分化法の改善を目指した。
着床後胚由来のマウスエピブラスト幹細胞(EpiS 細胞)は、従来の着床前胚由来のマ
ウス ES 細胞とは異なる特徴を有しており、マウス ES 細胞とマウス EpiS 細胞にそれ
ぞれ対応する「ナイーブ型」と「プライム型」という概念が提唱されている。ヒト ES
細胞は、コロニー形態や解離に対する脆弱性といった点において、マウス ES 細胞よ
りもマウス EpiS 細胞と類似しており、プライム型である考えられている。そこで、本
研究では、ヒト ES/iPS 細胞をナイーブ型へと転換すれば、マウス ES 細胞と同様の方
法で AVP ニューロンへとより効率的に分化させることができるという仮説を検討し
た。
【対象及び方法】
Cys98stop 変異を有する FNDI 特異的 iPS 細胞(FDI-02)をナイーブ化キットである
RSeT feeder-free medium で培養し、コロニーの形態の変化を観察し、ナイーブマーカー
(TFCP2L1, KLF4, SELLA)を蛍光免疫染色および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応

-1-

(RT-qPCR)で評価した。
ナイーブ化した FDI-02 を無血清浮遊培養(SFEBq 法)で立体的に培養し、分化誘導
を 行 っ た 。 分 化 の 各 段 階 の マ ー カ ー と し て 、 PAX6, OTP, BRN2, AVP, NPII, 変 異
NPII(mNPII), copeptin を蛍光免疫染色にて評価した。健常者由来の iPS 細胞(201B7)
についても同様の分化誘導実験を行った。
【結果】
RSeT feeder-free medium での培養により、コロニーの形態は平坦からドーム状へと
変化し(Fig. 1A, B)、蛍光免疫染色で TFCP2L1, KLF4 の発現を(Fig. 1C-F)、RT-qPCR で
TFCP2L1, STELLA の有意な発現上昇を確認した(Fig. 1G, H)。
ナイーブ化によって、KSR 濃度は、従来のヒト ES 細胞での 5%に対し、0.7%に留め
た上で、嚢胞化、崩壊は有意に減少し安定した凝集体の形成が可能になった(Fig. 2B,
C)。ナイーブ化を行い KSR の添加を最小限に留めることで、分化開始 30 日目時点で
の BRN2 の発現率が有意に増加した(Fig. 2D, E)。分化開始 30 日目時点で視床下部前
駆細胞(PAX6+, NKX2.1-, FOXG1-)(Fig. 3B)、60 日目時点で AVP ニューロン前駆細胞
(OTP+, BRN2+)(Fig. 3C)へと in vivo での発生過程をたどるように段階的に分化が進
み、150 日目時点で、201B7 からの分化誘導では、AVP, NPII の発現が(Fig. 3D)、FDI-02
からの分化誘導では、それらに加え mNPII の発現が見られ(Fig. 4)、AVP ニューロン
への分化を確認した。また、他の視床下部神経マーカー(CRF, NPY, AgRP, TRH, Orexin)
の発現も確認した(Fig. 3E-I)。
【考察】
本研究では、分化前の細胞がナイーブ型かプライム型かという新しい視点で AVP ニ
ューロンの分化誘導法の改善を試み、2 つの成果を挙げた。1 点目は、ヒト iPS 細胞に
対して外因性シグナルを最小限に抑えた状態で SFEBq 法を行った際の、細胞の生存率
の低下、凝集体の崩壊、嚢胞形成といった問題を解決することができたこと。2 点目
は、ナイーブ化および外因性シグナルの最小化により、AVP ニューロンへの分化に必
須な転写因子である BRN2 が陽性となる細胞の割合の増加を達成したことである。こ
れらの知見は、AVP ニューロンの分化効率が向上したことを示唆している。
プライム型のヒト ES/iPS 細胞は、解離した際に Rho 活性の上昇によるアポトーシ
スを引き起こすことが知られており、ROCK 阻害剤による処理が必須である。AVP ニ
ューロンなどの中枢神経系の最吻側部を誘導するためには、分化の際に加わる外因性
シグナルを最小化することが必要であるが、ROCK 阻害剤のみではプライム型のヒト
ES/iPS 細胞の凝集を維持することができず、KSR などの栄養素をある程度添加する必
要があり、結果として FOXG1 陽性の大脳組織へと分化してしまった。大脳から視床
下部への再配置のために、さらに BMP4 と SHH のシグナルを用いた AVP ニューロン
への分化方法を我々は以前に報告したが、これは、一度後方化した細胞を前方に再配
置するという 2 段階のプロセスであり、視床下部組織の分化効率の低さにつながって

-2-

いるものと考えられる。ナイーブ化により ROCK 阻害剤と KSR の添加を最小限に抑
え、よりシンプルでわかりやすい分化の方向性をもたらしたことが、今回の視床下部
吻側への分化効率向上の一因であると思われる。
Cys98stop 変異を有する FNDI モデルマウスの解析では、mNPII は AVP ニューロン
の ER associated compartment(ERAC)に蓄積していることが明らかになっている。今回、
我々は同様の変異を有する FDI-02 由来の AVP ニューロンにおける mNPII の発現を明
らかにした。ER における変異タンパク質の蓄積は、FNDI を含む多くの疾患の病態生
理に関与しているため、今回報告した AVP ニューロンは、幅広い疾患の研究に応用可
能な ER ストレスの有望なヒトモデルである。マウスで確認された ERAC などの特徴
的な構造を電子顕微鏡による解析で捉え、より詳細な病態解析を進めることが今後の
課題である。
本研究でのナイーブ化においては、ナイーブマーカーの 1 つである KLF4 の発現が
限定的であり、ナイーブ化の程度は部分的であったかもしれないが、上記の外因性シ
グナルの最小化や視床下部吻側への分化効率の向上に十分な役割を果たした。「部分
的な」ナイーブ化が、より良い結果をもたらしたのかもしれない。これまでに複数の
ナイーブ化の手法が報告されており、ヒト ES/iPS 細胞から分化誘導を開始する際の細
胞の最適な状態を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。本研究をもと
に、分化方法の改良、変異タンパク質の発現パターンの詳細な解析、創薬に向けた機
能的な検討を進めていく。
【結語】
ナイーブ化によって FNDI ヒト疾患特異的 iPS 細胞からの AVP ニューロンの効率的
な分化誘導を可能にした。

-3-

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Acknowledgements

The authors are grateful to Ayaka Nishiyama for establishment of human FNDI-specific iPSCs. They thank

Akiko Tsuzuki for technical assistance, and all members of the Arima laboratory for valuable discussions. They

would like to thank Editage (www.​edita​ge.​com) for English language editing. This work was supported by grants

from the Program for Intractable Disease Research Utilizing Disease-Specific iPS Cells from the Japan Science and Technology (JST) agency and the Japan Agency for Medical Research and Development (AMED)

(K.M, JP15bm0404009, JP16bm0609002), the Project for Technological Development (to H.S.) of the Research

Center Network for Realization of Regenerative Medicine (RCNRRM), funded by AMED (JP17bm0404018,

JP20bm0404036), the Acceleration Program for Intractable Diseases Research Utilizing Disease-Specific iPS

Cells (to H.S.) of RCNRRM funded by AMED (JP19bm0804011), Grants-in-Aid for Scientific Research (to

H.S.) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan (MEXT; JP17K09878,

JP20K08859), Nagoya University Hospital Funding for Clinical Research (71004136; to H.S.), Fusion Oriented

Research for disruptive Science and Technology (FOREST) by Japan Science and Technology Agency (JST),

the Hori Sciences and Arts Foundation, the Toyoaki Scholarship Foundation, the Daiko Foundation, the Nitto

Foundation, and the Suzuken Memorial Foundation.

Author contributions

H.O. performed cell culture, immunohistochemistry, made all figures, and wrote the majority of the manuscript.

H.S. conceived and designed the study and edited the manuscript. M.Sakakibara and M.Soen provided technical

support. T.Miwata and K.M. discussed all experimental results. N.M., S.T., T.N. and M.K. provided useful advice

on the SFEBq method. T.Miyata, H.T. and D.H. regularly advised on the results and figures. T.K., M.S., T.O.,

S.I., R.B. reviewed the manuscript. G.I. and Y.T. recruited FNDI patient. K.M. and H.I. generated FNDI-specific

iPSCs. H.A. led and directed this study. All co-authors discussed and commented on the manuscript.

Competing interests The authors declare the following competing interests: Shiori Taga is an employee of Sumitomo Dainippon

Pharma Co., Ltd. The other authors declare no competing interests.

Additional information

Supplementary Information The online version contains supplementary material available at https://​doi.​org/​

10.​1038/​s41598-​022-​22405-8.

Correspondence and requests for materials should be addressed to H.S.

Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.

Scientific Reports |

Vol:.(1234567890)

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