論文の公開元へ生体軟骨組織細断装置を用いた新規再生軟骨作製法の開発
概要
研究背景
軟骨は、身体のさまざまな部位に見られる半剛性で弾性のある無血管結合組織であり、顔面領域では、輪郭を維持し、顔の動きを柔軟にしている。口唇口蓋裂、小耳症などの先天性疾患、外傷、悪性腫瘍などによって引き起こされる審美的、機能的障害には、インプラントを使用した再建手術が適応となる場合がある。鼻背の増強には様々な非吸収性人工材料が用いられるが、異物反応、周囲組織の石灰化、位置異常と変位、穿孔および露出などを引き起こす可能性がある。これらの問題を回避するために、自家組織として耳介軟骨、鼻中隔軟骨および肋軟骨がしばしば用いられる。肋軟骨は、胸部変形や疼痛、もともとの湾曲した形状に戻ろうとすることによる経時的変形などの問題点がある。耳介および鼻中隔軟骨には、使用可能な量に制限があり、形態修正に充分な量の組織が採取された場合、耳介または鼻が変形するリスクがある。
再生医療は、細胞、足場、成長因子、またはその組み合わせにより組織または臓器を再生する技術である。当研究室で開発したインプラント型再生軟骨の作製においては、自己耳介軟骨から軟骨細胞を酵素処理によって単離し、拡大培養した後に、三次元構造と機械的強度を付与するためポリL乳酸足場素材に投与する。しかし、軟骨細胞の単層拡大培養による脱分化や、コラゲナーゼ酵素処理による細胞障害、生体分解性足場素材に対する生体反応は、軟骨の形成に負の影響を与える。足場を用いない再生組織も開発されているが、移植時から組織成熟までの間に加わる負荷に耐えうる機械的特性を備えた再生組織はまだ実現されていない。
酵素処理や平面培養を行わない方法として、肋軟骨を破砕したdicedcartilageの小耳症や頭蓋冠の治療への応用も報告されているが、軟骨小片は三次元形状が付与されていない状態で移植されている。生体軟骨組織細断装置を用いて軟骨小片を作製し、これを足場材料・basic fibro blast growth factor徐放化システムと組み合わせて移植することで，軟骨が形成されることを示した報告もあるが、足場材料であるPGAメッシュが免疫反応をもたらす可能性がある。
目的
細胞障害を生じうる酵素処理、脱分化が伴う平面培養、免疫反応を生じうる足場に依存した三次元形状付与方法を抜本的に改善する再生軟骨作製法を実現するため、軟骨小片を用いたスカフォールドフリー再生軟骨の作製法について検討した。
方法
生体軟骨組織細断装置による軟骨小片の作製永⽥⼩⽿症形成外科クリニック(埼⽟県⼾⽥市)にて⼿術を受ける⼩⽿症患者由来の⽿介軟⾻組織を同意取得の上で譲り受け、軟⾻膜を剥離後、⽣体軟⾻組織細断装置を⽤いて⼀辺200µmのキューブ型の軟⾻⼩⽚に細切した。
Invitro
1.軟⾻⼩⽚の培養作製した軟⾻⼩⽚1000個をStandard Culture PlateおよびUltra-Low Attachment Plateで培養した。培地はDMEM/F12、10%FBS培地、IGF-1培地のいずれかを各5mL/wellで加え、37℃、5%CO2下で培養した。培養8週、12週間後に回収し、組織学的評価を⾏った。また、培養初期(0-5週間)の軟⾻⼩⽚を週に1回電動倒⽴型顕微鏡(Leica,DMi8)を⽤いて観察し、12週まで週に1回デジタルカメラで記録した。更に、凝集体における軟⾻基質産⽣を促す条件を検討するため、10％FBS培地で8週間（8w/-）または12週間(12w/-）、10％FBS培地で5週間培養し、その後IGF-1培地で3週間または7週間（それぞれ5w/3wおよび5w/7w）、または10％FBS培地で7週間、その後IGF-1培地で5週間（7w/5w）培養した。
2.⼤きさの評価凝集化による⼤きさの変化を、⾮接触光学式3次元スキャナATOSⅢ Triple Scanを⽤いて測定し、拡⼤率を算出した。
3.タイムラプス撮影10%FBS培地で3週間培養後のサンプルを使用し、KEYENCE(BZ-X700)で3日間タイムラプス撮影を行った。
4.組織学的評価各組織を4%パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋後、TB、HE染色の他、免疫化学染色として、periostin、PCNA、MMP-13、TRA-1-60、SSEA-3に対する染色を行った。
Invivo
1.移植による軟⾻⼩⽚由来再⽣軟⾻の有⽤性評価前述の方法で作製した軟骨小片由来再生軟骨をヌードマウスの背部皮下に移植し、8週間後に再生軟骨組織を摘出し、解析した。
2.ImageJによる画像解析組織切片を用いて、生体内での基質産生を評価した。新生基質の割合は、新生基質面積/回収組織の軟骨部分面積x100、拡大率は回収組織全体の面積/元の軟骨基質の計算上の面積（組織切片に含まれる軟骨小片の個数x40,000µm2）で算出した。
3.⼒学的評価Venustron Alphaversion 5.4Jで、0.3mm押し込み時のヤング率(MPa）を測定した。
結果
Invitro
1.単純培養：細切後の軟⾻⼩⽚の凝集の必要条件Ultra-Low Attachment Plateで培養を行なった10%FBS群でのみ、約5〜6週で軟骨小片同士が三次元的に集合、凝集し、軟骨小片の凝集体外層に膜様組織が形成された。DMEM群、IGF-1群では凝集は起こらなかった。StandardCulturePlateでは全ての群で凝集は起こらなかった。
2.複合培養：軟⾻基質を形成する条件凝集が起こった時点で、IGF-1培地で培養し、分化誘導を行った。組織切片を作製して、HE染色およびTB染色で基質形成を評価した。7w/5wで最も良好な基質産生が見られた。
3.体積の評価培養後の凝集体の⼤きさは5w/7wでは18.53mm3±4.064mm3、12w/-では15.69mm3±1.796mm3であり、培養条件による差は認められなかった（p=0.55）が、いずれのサンプルも培養開始前の軟⾻⼩⽚と⽐較して体積は増⼤していた。
4.凝集体形成における細胞動態解析培地中に浮遊している細胞が、軟骨小片同士の間に徐々に集積していく様子が観察された。5.間質細胞の特性7w/5wではperiostinもPCNAも陽性であった。7w/-においてはperiostin陰性で、間質に存在する細胞は少ないが、基質辺縁に存在する細胞でMMP-13は陽性であった。細切直後では全て陰性であった。TRA-1-60、SSEA-3に対する免疫染色では、5w/7w,12w/-では陽性細胞が見られたが、nativecartilage,およびdicedcartilage由来の軟骨細胞では陰性であった。
Invivo
1.凝集体移植時の軟⾻再⽣能についての検討非接着培養を行なって得られた凝集体および細切直後の軟骨小片をヌードマウスの背部皮下に移植し、8週後に回収して組織学的評価を行なった。7w/5wを移植したもの(7w/5w/8w)が、最も良好な基質産生を示しており、invitroの組織所見とも一致していた。
2.ImageJを⽤いた解析の結果、新⽣基質の割合、拡⼤率共に、7w/5w/8wにおいて、他の培養条件と⽐較して、有意に⾼値となった。(p=0.000)
3.⼒学強度は7w/5w/8wでは12w/-/8w(p=0.000)、直後/8w(p=0.000)、5w/7w/8w(p=0.000)と⽐較して有意に⾼値となった。
考察
軟骨を器官培養すると、軟骨小腔から細胞が遊走することが報告されている。今回の検討では、非接着条件で軟骨小片を10%FBS培地で培養した際には、凝集した軟骨小片の間質に細胞が観察された。タイムラプス観察では、培地中に浮遊している細胞が軟骨小片間に集積している像が見られたことから、軟骨小片から遊走し、培地中に放出された細胞が集積して、間質を形成したことが考えられる。
また、今回の検討では、10%FBS培地のみで凝集体が得られたが、これは10%FBSを含む培地で軟骨細胞を培養すると大きな凝集体が得られるとした先行文献と一致する。一方、IGF-1は細胞増殖、軟骨組織形成、軟骨分化を促進する働きがあることなどが報告されているが、今回の検討でもIGF-1培地で培養を行うことで、間質の細胞増殖および基質産生が認められた。興味深い事に、7w/5wでは、5w/7wよりも軟骨基質形成が良好であった。培地の切り替えのタイミングにおける、2週間の差がこのよう差異を生じる理由の解明についてさらなる検討を行うことで、培養条件の最適化につながる所見が得られる可能性がある。
さらに、これらの条件で培養した凝集体について、移植後の軟骨再生能を検討した。先行研究においては、移植前の軟骨細胞三次元培養に用いる培地として、分化培地を用いた場合に移植後の軟骨再生が良好であるとする報告がある一方で、増殖培地を用いた方が良好な再生軟骨が得られたとする報告もある。本研究では、増殖培地からIGF-1を含んだ分化培地に切り替える複合培養を行うことで、移植後に良好な軟骨組織形成が得られた。
細切直後の軟骨小片、10%FBS培地で7週培養した軟骨小片由来凝集体と、さらに5週IGF-1培地で培養した凝集体の組織切片の比較では、PCNA陽性細胞は間質に見られ、軟骨小片から遊走した細胞が12週後も良好に増殖していることを示した。IGF-1培地での培養後に見られたperiostinは、コラーゲン組織の高次構造化を促進して、再生組織の成熟に寄与した可能性がある。タンパク分解酵素であるMMP-13は、IGF-1により発現が低下するという報告がある一方、逆に発現が上昇するという報告もある。本研究において、MMP-13は増殖培地による培養後には僅かな細胞で陽性であったが、さらにIGF-1培地による培養で陽性細胞が増加した。基質からの細胞遊走にはタンパク分解酵素の関与が考えられるが、細胞の遊走は凝集体形成時7週までに既に生じており、この過程における基質分解には他のタンパク分解酵素の関与が示唆される結果となった。
軟骨細胞を平面培養すると脱分化が生じるが、3次元培養では軟骨基質形成能が維持されるとの報告が複数ある。移植後の軟骨再生には、軟骨幹・前駆細胞が大きく貢献すると考えられていることから、幹細胞マーカーとして知られているTRA-1-60,SSEA3の発現を検討した。本研究において、細切直後の軟骨小片由来細胞を平面培養するとTRA-1-60およびSSEA-3は陰性であったが、非接着plateで三次元培養すると、IGF-1刺激の有無にかかわらず間質細胞はTRA-1-60、SSEA-3陽性となった。これらの結果は、軟骨小片の凝集体を三次元培養することで生じた間質細胞は幹細胞特性を有することを示唆した。
結論
生体軟骨組織細断装置を用いて作製した軟骨小片自体をコラゲナーゼ処理することなく細胞の供給源として軟骨基質ごと培養し、凝集させることで、脱分化させることなく、少量の軟骨から大きな再生軟骨を作製できる可能性が示唆された。
この論文で使われている画像
