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収縮型培養ヒト筋細胞系を用いたマイオカインR-spondin-3の作用機序に関する研究

高橋 忠久 東北大学

2022.03.25

概要

高齢化社会の到来に伴い筋の萎縮によるサルコペニアや廃用症候群治療がます ます重要性になっている。しかし、ヒト筋細胞分化の機序は未だ十分には解明 されていない。筋細胞は、筋衛星細胞が分化融合して多核の筋管細胞をつくり、これが成熟して筋線維となる。しかし、培養ヒト筋細胞では収縮能力が不十分 な筋管しか作れず、ヒト筋細胞のみの実験系の構築は困難だった。神崎らはヒ トとマウスのハイブリッド筋細胞に周期的な電気パルス刺激を与えることで収 縮型培養筋細胞系を確立し、筋由来のサイトカインであるマイオカインの候補 を多数同定した。Wnt シグナル経路を活性化し細胞増殖、細胞極性の調整を行うR-spondin-3（RSPO3）もその１つである。しかし、RSPO3 のヒト筋細胞での 役割を示した報告は渉猟した限り見られない。本研究の目的は収縮型ヒト培養 筋細胞系を用い RSPO3 の役割と作用機序を調べることである。

実験には市販のヒト筋衛星細胞と、肩関節鏡視下腱板修復術の際に採取した正常筋組織から単離、培養したヒト筋衛星細胞を使用した。ヒト筋衛星細胞を分化させ、7 日目で 26 時間電気パルス刺激を行い、収縮型ヒト培養筋細胞系を構築した。RSPO3 は分化 2 日目から発現が見られ、電気パルスによる収縮刺激で著明に増加した。RSPO3 が運動応答性マイオカインであることを明らかにした。

次にRSPO3 抑制によるヒト筋細胞分化への影響を調べるために、分化初日から RSPO3 特異的 siRNA をトランスフェクションし RSPO3 を抑制した。電気パルス刺激後に免疫染色で観察したところ、RSPO3 抑制群では筋管の肥大や、筋細胞と筋衛星細胞の融合が著明に阻害された。RSPO3 が筋分化を制御していることが示唆された。電気パルス刺激時のRSPO3 抑制が、運動に応答し発現上昇する細胞内タンパク質である Actin-Binding Rho Activating Protein (ABRA)や運動応答性マイオカイン（Interleukin-6 (IL-6)、Interleukin-8 (IL-8)、C-X-C Motif Chemokine Ligand 1 （CXCL1））に与える影響も調べた。RSPO3 特異的 siRNA と ABRA 特異的 siRNA をトランスフェクションしRSPO3 抑制群と ABRA 抑制群を作成した。ABRA 抑制群では RSPO3 mRNA の発現は低下しなかったが、RSPO3抑制群では ABRA mRNA の発現が有意に低下した。RSPO3 は ABRA の上流で作用している可能性がある。ABRA 関連タンパク質である ras homolog gene family, member A（RhoA）は細胞骨格と細胞極性を調整する Wnt/PCP シグナル経路の下流に位置しており、RSPO3 がこのシグナル経路を介している可能性がある。一方で、筋分化に必要とされる IL-6、IL-8 mRNA の発現は変化しなかった。

近年の研究で糖尿病治療薬であるメトホルミンがリハビリテーションの筋力改善効果を低下させるという報告がある。ヒト筋細胞におけるメトホルミンのリハビリテーション効果減弱と、RSPO3 を含めた運動応答性マイオカインの関係を調べた。ヒト筋細胞を培養、分化させ、電気パルス刺激開始時からメトホルミンを添加した群と、メトホルミンの作用の１つであるアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を特異的に活性化させる AMP- activated protein kinase activator を添加した群を作成した。メトホルミン添加群では全ての運動応答性マイオカイン（RSPO3、IL-6、IL-8、CXCL1）の発現が減少した。運動応答性マイオカインの発現抑制がメトホルミンのリハビリテーション効果減弱に関与している可能性がある。また、AMP-activated protein kinase activator 添加により RSPO3 mRNA が減少した。RSPO3 の上流でリン酸化 AMPKが作用したと考えられる。

最後に肩関節鏡視下腱板修復術の際に採取したヒト筋組織の免疫染色と、マウス下腿に電気パルス刺激を負荷した際の RSPO3 mRNA の発現を調査した。ヒト筋組織の免疫染色ではRSPO3 がヒト筋細胞の細胞膜辺縁に集中して観察された。RSPO3 が筋細胞表面で細胞の融合を促している可能性がある。また、in vivo でも電気パルス刺激したマウスで RSPO3 mRNA が増加しことから、RSPO3が生体内でも運動に反応して発現、上昇することが確認された。本研究は RSPO3 が筋由来のマイオカインであり、筋細胞の分化・成熟に重要な役割を果たしていることを初めて明らかにした。RSPO3 の機序解明がサルコペニアや廃用症候群の治療に繋がる可能性がある。

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