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卵白タンパク質分子の加熱による高次構造変化およびゲル形成機序に関する研究

小山 翔大 東京農業大学

2021.09.22

概要

鶏卵は家庭での調理のほか、各種の加工品として全世界で広く利用されている(Yangand Baldwin, 1995)。鶏卵は卵殻、卵殻膜、カラザおよび可食部の卵黄および卵白からなる。卵黄の主成分は脂質およびタンパク質で、優れた乳化性を活かしてマヨネーズ製造等に重用されている。卵白は主に水分(84~89%)およびタンパク質(10~11%)、微量成分の脂質(0.03%)、糖質(0.9%)および無機物により構成される(Guha, Majumder, & Mine, 2018)。中でも卵白タンパク質は加熱ゲル化性、起泡性および乳化性に代表される優れた加工機能を示す。これら機能性を単体または組み合わせて、焼き菓子やパンの製造、畜肉加工品、水産練り製品および中華麺の物性改良などに幅広く利用されている(Mine, 1995)。

卵白タンパク質の大半は球状タンパク質で、オボアルブミン(OVA,54%)、オボトランスフェリン(OVT,12%)、オボムコイド(OVM,11%)、オボグロブリンG2,G3(各4%)リゾチーム(LYZ,3.4%)により構成され、そのほかに繊維状のオボムチン(3.5%)が含まれる(Alleoni, 2006, Fig. 1)。OVAは385残基からなる分子量44.5kDa、等電点4.5の卵白の主要タンパク質で、ゲル形成の主体とされている。OVAはアスパラギン結合型糖鎖を有し、分子内に4個の遊離システイン残基および1個のジスルフィド(SS)結合を有するほか、リン酸化の程度が異なる分子種が存在する(Alleoni, 2006)。ネイティブなOVA(n-OVA,変性温度(Td)=78.6°C)は鶏卵の貯蔵過程にて、熱変性温度の高い分子種であるstable-OVA(S-OVA, Td=83.4°C)およびこれらの中間体であるIntermediate OVA(I-OVA, Td=87.0)に構造変化する現象(S化)が生じることが報告されている(DeGroot & DeJongh, 2003)。このOVAのS化はゲル物性に影響するとされる(Shitamori, Kojima, & Nakamura, 1984)。

OVTは分子量77.7kDaで等電点6.1を示す糖タンパク質で、分子内にSS結合を15個有する。OVTは熱安定性が低いタンパク質であるため、加熱凝集特性ならびに凝集抑制に着目した研究がなされてきた(Matsudomi et al., 1991; Mizutani et al., 2006; Nakamura, Umemura, & Takemoto, 1979)。

OVMは20-25%の糖鎖を含有する糖タンパク質で、トリプシンインヒビター活性を持つタンパク質である(Alleoni, 2006)。なお、OVMは変性温度に達してもゲルネットワークには取り込まれず、ゲルマトリックスに存在するため、加熱ゲル形成には影響しないタンパク質である(Handaet al., 1998)。オボムチンおよびオボグロブリンG2,G3はメレンゲの調製など、起泡性の発現に深く寄与することが報告されている(Alleoni, 2006)。

LYZは分子量14.3kDa、等電点10.7を示し、分子内にSS結合を4個有するタンパク質で、細菌の細胞壁分解活性をもつ(Mine,1995)。LYZの等電点はアルカリ性側で、他の主要卵白タンパク質では酸性側であり、中性~弱アルカリ性pH域において正電荷を帯びたリゾチームは、負電荷を帯びたOVAをはじめとする他のタンパク質と静電気に相互作用するため、加熱凝集や起泡性への影響に関する研究が盛んになされてきた(Garibaldi et al., 1965; Matsudomi et al., 1991)。

各タンパク質の加熱凝集における相互作用については、その取り扱いの容易さや適用できる試験の幅広さから、主にゲルを形成しない希薄溶液を用いて研究がなされてきた。中性またはアルカリ性条件下において、負に帯電したOVAおよびOVTはそれぞれ正に帯電したLYZと静電引力により強い親和性を示し、共存により凝集体の粒径が増大することが報告されている(Iwashita, Handa, & Shiraki, 2017, 2019; Matsudomi et al., 1991)。一方、OVTはOVAの共存下において加熱凝集が抑制され、OVAの変性度が高いほどその効果は高まるとされている(Matsudomi,Oka,&Sonoda,2002)。以上のように、加熱凝集に関する研究は、OVA、OVT、およびLYZを中心になされ、高濃度の卵白タンパク質溶液における加熱凝集により形成されるゲルの構造および物性発現においても、OVA、OVT、およびLYZは重要な役割を担うと考えられてきた。

Johnson & Zabbik (1981)は様々な方法で精製した卵白タンパク質を単体または混合して、一定タンパク濃度に調製した加熱ゲルの硬度を測定した結果より、LYZ単体および混合試料は硬いゲルを形成する傾向にあることを示した。この試験では、様々な方法で調製したタンパク質を使用しているため、各タンパク質本来の性状に加えて、精製方法ごとに異なる変性が生じている可能性がある。また、この試験は、各タンパク質が同一の比率で混合されているが、卵白中のタンパクとは組成が異なる条件で行われている。以上のように、卵白加熱ゲルの構造および物性発現における、各タンパク質の寄与に関しては十分に解明されていない。

卵白の加熱ゲルは、卵白タンパク質の加熱変性により結合領域が露出し、結合領域同士の相互作用を介して形成された凝集体がさらに重合することにより形成される(Mine,1995,Fig.2)。卵白をはじめとする球状タンパク質の加熱ゲルは、球状を保ったまま細長く、数珠玉状につながった会合体が絡み合って会合体を形成する数珠玉モデル、および塊状の凝集体を形成しこの凝集体同士が寄り集まって隙間の多い網目状構造を形成するランダム凝集体モデルの2種類に大別されると考えられている(Doi,1993)。Doiらは、種々のイオン強度やpHにて調製したOVAの加熱ゲルについて、透明なゲルが形成される場合は数珠玉モデルが、不透明ゲルが形成される場合はランダム凝集体モデルが適用されることを見出した(Doi, 1993)。

また、この凝集および重合過程においては、疎水結合、水素結合、イオン結合などの非共有結合および、SS結合のような共有結合が関与することが、長らく定説とされてきた(Phillips, 1994)。中でも、SS結合はゲルの硬度形成に寄与すると報告されている。しかし、卵白ゲルを10M尿素および5%(v/v)2-メルカプトエタノールにて処理し、疎水、水素およびSS結合を切断しても、可溶化しないとの報告もある(Beveridge et al., 1980)。したがって、SS結合以外の共有結合が卵白ゲル形成に関与する可能性が推察されるが、十分な知見は得られていない。

食品産業において、チルドまたは冷凍状態で流通している液卵白または常温保存が可能な乾燥卵白がしばしば用いられている。乾燥卵白の中には、液卵白と同等のタンパク質濃度に調整した水溶液を加熱ゲルすると、液卵白にはない硬く弾力に富んだゲルを形成するものがある。同性質は、畜肉、すり身加工品および中華麺などのタンパク質性食品に硬さおよび弾力性を付与する物性制御に重用されている。

乾燥卵白は液卵白を脱糖および噴霧乾燥し、乾燥状態にて60~80°Cで3~30日加熱処理(乾熱処理)することにより製造される(Handa et al., 2001)。この中でも、優れたゲル化性の発現には、乾熱処理が重要な役割を果たし、その処理時間が長いほどゲル硬度が向上するとされる(Kato et al., 1989)。上記の背景から、乾熱処理が卵白タンパク質に与える影響ならびにゲル機序に関する研究が盛んに行われてきた。Katoら(1990a)は、乾熱処理した卵白タンパク質は希薄溶液にて加熱した際に凝集が抑制されることを明示し、その結果規則正しいネットワーク構造を持つ硬いゲルが形成されると提唱した。また、その際に乾熱処理により形成されるタンパク質可溶性凝集体がゲル構成単位になる可能性にも言及した。可溶性凝集体は乾熱処理の強度およびpHが異なる乾燥卵白製品を分析した結果より、その平均分子量とゲル強度の間に強い正の相関が認められている(Handa et al., 2001)。卵白タンパク質およびOVAそれぞれの乾熱処理により、両者の表面負電荷が増加することも報告されている(Maetal., 2019; Mine, 1997)。したがって、タンパク質の静電反発力の増強が凝集を抑制し、ゲル形成に寄与する可能性も推察される。しかし、Ogawaら(2003)は凍結乾燥後乾熱処理した卵白およびOVAの水溶液よりゲルを調製する際、静電反発力を抑制するNaClを添加してもゲルの硬度に濃度依存的な傾向はみられないと報告しており、タンパク質表面負電荷のみでは高硬度ゲル形成要因の説明は困難である。Katoら(1990b)はさらに、示差走査熱量(DSC)分析の結果より、卵白タンパク質は乾熱処理によりゲル形成時にタンパク質の変性に要するエネルギーおよび変性温度が低下し、タンパク質分子のフレキシビリティが高くなることも明らかにし、同現象も高硬度ゲル化に寄与する可能性があると言及している。しかし、タンパク質分子が変性しやすくフレキシビリティが高いほど、溶液中での加熱により疎水領域スルフィドリル(SH)基が露出しやすく、分子間相互作用しやすくなると考えられるため、両仮説についてはさらに検証し、妥当性を検討する必要がある。以上のように、乾熱処理による高硬度ゲル形成能獲得機序については有力な仮説は提唱されているものの、未だ結論が得られていない。さらに、凝集抑制や分子間相互作用の強化がなぜ生じるかなど、詳細な機構解明には至っていない。

以上の背景を踏まえて、本研究では、オボアルブミンおよびその他タンパク質のゲル形成への寄与、ゲル形成における共有結合の共有結合の寄与について解析すると共に、乾燥卵白ゲルが高硬度化する機序の解明に取り組んだ。

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