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CDK5 Regulatory Subunit-Associated Protein 1-like 1 Negatively Regulates Adipocyte Differentiation through Activation of Wnt Signaling Pathway

武, 和巳 東京大学 DOI:10.15083/0002002719

2021.10.27

概要

序文
2型糖尿病（T2DM）および肥満は、心血管疾患の主要な危険因子であり、遺伝的および環境的要因によって引き起こされる。一連のゲノムワイド関連研究により、CDKAL1 遺伝子座における一塩基多型(SNP)が2型糖尿病と有意に関連していることが示されている。それに加えてCDKAL1のSNPが成人および小児の体格指数(BMI)と関連があることが示されている。 近年の研究によって、CDKAL1はtRNA Lys (UUU)修飾酵素であることが報告されている。 CDKAL1がβ 細胞においてプロインスリンのLysコドンの正確な翻訳に必須であり、膵 β 細 胞特異的 CDKAL1欠損マウスではプロインスリン合成異常が生じることで、小胞体ストレスの増加やインスリン分泌異常が引き起される。また別の報告では、高脂肪食負荷 CDKAL1欠損マウスが摂食量低下および低体重を示すが、20 週間の高脂肪負荷後においては、この低体重表現形は消失すること、インスリン分泌低下およびインスリン抵抗性を示し、さらに肝臓および筋肉の脂質含量の増加が観察された。
このようにCDKAL1と糖脂質代謝の関連についていくつかの研究が報告されているが、これまでCDKAL1の脂肪細胞分化に対する機能的役割については検討されていない。そこで、私は脂肪細胞分化におけるCDKAL1の役割について検討した。この報告において、CDKAL1が脂 肪細胞に発現し、CDKAL1がWntシグナル伝達経路を活性化することによって脂肪細胞分化を負に調節することを明らかとした。

方法
マウス組織及び3T3-L1 脂肪細胞におけるCDKAL1 発現量を定量的 PCR (qPCR)で解析した。CDKAL1の機能を解析するために、レトロウイルスによってCDKAL1、またはCDKAL1を標的とするshort hairpin RNA (shRNA)を安定的に過剰発現する3T3-L1 細胞を作製した。 CDKAL1によるWntシグナル伝達経路へ作用を解析するために、Wntシグナル関連分子(β -catenin、GSK-3β)タンパク量のWestern-blottingによる解析、シグナル関連分子の発現量のqPCRによる解析、およびWntシグナル活性評価系であるTOPFLASH (TCF Reporter Plasmid)アッセイを行った。CDKAL1の分子メカニズムを解析するために点変異導入法によりCDKAL1のアミノ末端領域に存在する鉄―硫黄クラスターを形成する6つのシステイン残基をセリン残基に置換した変異体を作製した。

結果
マウス組織において、脂肪組織におけるCDKAL1 発現量が膵臓と同程度であることを見出した。3T3-L1 細胞に脂肪細胞分化誘導を行うと、分化に伴いCDKAL1の発現が上昇した。
脂肪細胞分化におけるCDKAL1の機能的役割を検討するために、CDKAL1を安定的に過剰発 現する3T3-L1 細胞に脂肪細胞分化誘導を行った。その結果、脂質蓄積および、脂肪細胞特異的 遺伝子の発現が顕著に抑制された。一方、shRNAによるCDKAL1ノックダウン実験によって、 脂肪細胞分化誘導時における脂質蓄積の増加や脂肪合成関連遺伝子の発現上昇が認められた。
次に脂肪細胞分化時の転写因子の経時的発現変動を解析した。野生型細胞では分化誘導刺激後にC/EBPβ、C/EBPδの迅速かつ一過的な発現誘導が起こり、続いて分化の後期にPPARγおよびC/EBPαの発現が増加した。CDKAL1 過剰発現細胞においてはPPARγおよびC/EBPαの発現は顕著に抑制されていたが、C/EBPβおよびC/EBPδの発現レベルは変化しなかった。 CDKAL1による脂肪細胞分化の抑制は、PPARγアゴニストによっては完全に解除されないが、 PPARγを過剰発現させることによって脂肪合成関連遺伝子の発現および脂質蓄積が回復した。
Wnt/β-cateninシグナル伝達経路は、PPARγ 発現および脂肪細胞分化の阻害経路の1つであることが報告されている。CDKAL1 過剰発現細胞においてβ-cateninの増加が認められた。このβ -cateninの増加は脂 肪 細 胞分化誘導前からみられることから、 CDKAL1によるWnt/β-cateninシグナル伝達経路の活性化が脂肪 細 胞分化を負に制御していることが示唆された。このことは、CDKAL1ノックダウン細胞においてβ-cateninが低下したことと一致する。
CDKAL1の過剰発現によって不活性型であるSer9リン酸化GSK-3βが増加したことから、 CDKAL1はGSK-3βの抑制を介してWnt/β-cateninシグナル伝達経路を制御することが示唆された。TOPFLASHアッセイおよびWnt/β-cateninシグナル伝達経路の標的遺伝子の解析によって、CDKAL1の過剰発現がWnt/β-cateninシグナル伝達経路による遺伝子発現を活性化することを確認した。
CDKAL1の脂肪細胞分化抑制作用の分子メカニズムを検討した。CDKAL1のアミノ末端領域に、メチルチオトランスフェラーゼファミリーに保存された2つの鉄―硫黄クラスターを形成する6つのシステイン残基が存在する。これらのシステイン残基をセリン残基に置換したCDKAL1点変異体を作製した。この点変異体はCDKAL1の脂肪細胞分化抑制作用を大きく欠損していた。これまでの研究により、CDKAL1は鉄―硫黄クラスターを介してtRNA Lys (UUU)を2-メチルチオ修飾する酵素であることが報告されている。CDKAL1のこの酵素活性が脂肪細 胞分化抑制作用に重要であるか検討するために、CDKAL1をノックダウン、または過剰発現させた3T3-L1 細胞中のtRNA Lys (UUU) 2-メチルチオ修飾を定量した。CDKAL1をノックダウンした3T3-L1 細胞において、有意な修飾の低下が確認された。一方、CDKAL1を過剰発現する3T3-L1 細胞においてtRNA修飾の変化は認められなかった。これらの成績より、CDKAL1は既報のtRNA修飾活性とは異なる機構によって脂肪細胞の分化を抑制することが示唆された。

考察
CDKAL1 過剰発現およびノックダウン実験の結果より、CDKAL1が脂肪細胞分化抑制作用を有することが示唆された。一方、脂肪細胞分化においてCDKAL1 発現が上昇した。これらの成績はCDKAL1が、脂肪細胞における過剰な脂質蓄積を防止する負のフィードバックループを形成することを示唆している。また、今回の研 究において、 CDKAL1はWntシグナル伝達のCanonical 経路、non-canonical 経路などの機構を介して脂肪細胞分化抑制作用を発揮することが示唆された。CDKAL1の分子メカニズムとして、CDKAL1のアミノ末端領域における鉄―硫 黄クラスターを形成するシステイン残基は、脂肪細胞分化抑制作用に必須であることが明らかとなった。
これまでの研究において、CDKAL1の機能低下は膵臓におけるインスリン分泌を低下させることが報告されているが、今回の研究において脂肪組織における機能低下が脂肪細胞分化を亢進することが示された。これらのことより、CDKAL1欠損マウス、過剰発現マウスの複合表現型は、膵臓のみならず脂肪組織など様々な臓器での多様な作用によるものであることが示唆された。また、ゲノムワイド関連研究においてCDKAL1のSNPはインスリン分泌と強い相関を示すことが報告されているが、CDKAL1 SNPと遺伝子発現量の関係は明確ではない。一方、当研究室の研究において、ヒト脂肪組織におけるCDKAL1 遺伝子発現量とBMIが負の相関を示すことが見いだされている。これらのことから、CDKAL1 SNPと体重の関係については、CDKAL1の機能変化や各組織での発現量変化の詳細な解析が必要であることが示唆された。

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参考文献

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