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アシルトランスフェラーゼAwat1およびAwat2が生み出すマイバム脂質多様性とドライアイ防止における役割

澤井, 恵 北海道大学

2022.03.24

概要

涙液油層は⽔分蒸散防⽌，涙液の表⾯張⼒低下，涙液に適度な粘弾性を付与するといった役割を担う。油層を構成する脂質の⼤部分はマイボーム腺から分泌され，総称してマイバム脂質と呼ばれる。ドライアイ患者の約8割がマイボーム腺機能不全を⽰していることが報告されているものの，マイバム脂質の質や量を改善するような医薬品は未だ上市されていない。マイバム脂質の主成分はコレステリルエステル（CE）とワックスモノエステル（WE）であり，合わせて9割程度を占めると報告されている。また，これら以外にもO-アシル-ω-⽔酸化脂肪酸（OAHFA）やエステル結合の向き・⽔酸基の位置が異なる3種類のワックスジエステル（WdiE）などの多様なエステル分⼦クラスが存在する。これまでにCEについてはエステル結合を形成する酵素および⽣理的意義が明らかにされているが，その他のエステル分⼦クラスについては不明である。AWAT（Acyl-CoA wax alcohol acyltransferase）1および2は，in vitroの解析からWE合成酵素活性を有することが報告されている。しかし，これらがWE，あるいはOAHFA，WdiEなどのエステル結合含有マイバム脂質の産⽣に関与しているかは明らかにされていない。また，WEを含む多くのエステル結合含有マイバム脂質のドライアイ防⽌における役割は不明である。そこで本研究では，Awat1およびAwat2の各単独ノックアウト（KO）マウス（A1KOおよびA2KO），Awat1 Awat2⼆重KOマウス（DKO）を作製し，上記不明点の解明を⽬指した。

　CRISPR/Cas9システムを⽤いて上記KO／DKOマウスを作製した。野⽣型マウス（WT）が⼤きく⽬を開いていたのに対し，A1KOは⽬をやや閉じ気味にしており，A2KOおよびDKOはさらに⽬を閉じた状態でいた。WTのマイボーム腺開⼝部には塞栓は観察されなかったが，A2KOおよびDKOでは⽩い練り⻭磨き状，A1KOでは半液状の塞栓が観察された。融点を測定すると，WT由来のマイバム脂質が34℃であったのに対し，A2KOが62℃，DKOが57℃と⼤幅に上昇しており，A1KOでも39℃と上昇していた。また，A2KOおよびDKOマイボーム腺は全体的に肥⼤化していた。これらのマイボーム腺ではマイバム脂質の固化によって分泌が著しく阻害され，マイバム脂質が腺内部に蓄積していると考えられる。1分間あたりの瞬⽬回数を計数すると，WTがほとんど瞬⽬しなかったのに対し，A1KOでは4回程度，A2KOでは8回程度，DKOでは10回程度とそれぞれ瞬⽬回数が有意に増加していた。続いて，点眼した蛍光溶液が眼表⾯に⼀様に広がってから破壊されるまでの時間を測定する涙液安定性試験を⾏った結果，A1KOおよびA2KOどちらにおいても涙液層破壊時間の短縮すなわち涙液層の不安定化が認められた。⼀⽅，眼表⾯からの⽔分蒸散についてはA2KO，DKOのみで亢進していた。これらの結果より，Awat1およびAwat2の⽋損はどちらもマイボーム腺機能不全を引き起こし，特にAwat2の⽋損による影響が強いことが明らかになった。

　液体クロマトグラフィー連結タンデム質量分析（LC-MS/MS）によってWT，A1KO，A2KO，DKOのマイバム脂質中のWEとタイプ2ωWdiEを測定した。その結果，A2KO，DKOではWEが消失していたのに対し，A1KOでは減少していなかった。タイプ2ωWdiEについては，A2KOでWTの1割程度，DKOで1割未満にまで減少していたが，A1KOでは減少していなかった。これらの結果より，Awat2がWEとタイプ2ωWdiE産⽣に中⼼的な役割を果たすことが明らかになった。OAHFAをLC-MS/MSで測定した結果，A1KOでWTの3割程度にまで減少しており，A2KOでも6割程度にまで減少していた。したがって，Awat1がOAHFA産⽣において主要に働き，Awat2も補助的に関与することが明らかとなった。LC-MS/MSによるタイプ1ωWdiEの測定系はこれまで確⽴されていなかったため，本研究において標準品を合成し，測定系を確⽴した。WTマイボーム腺におけるタイプ1ωWdiE組成を調べたところ，飽和アルコールを有し，残りの脂肪酸とω⽔酸化脂肪酸部分の不飽和度の合計が三価あるいは⼆価のものが豊富であることが明らかになった。この系を⽤いてA1KO，A2KOおよびDKOのマイボーム腺中の三価不飽和タイプ1ωWdiEを測定したところ，A2KOでWTの2割程度，A1KOでWTの3割程度にまで減少しており，DKOでは消失していた。⼀⽅，⼆価不飽和についてはA1KOでWTの5割程度にまで減少，DKOでほぼ消失していたのに対し，A2KOでは減少していなかった。これらの結果より，三価および⼆価不飽和タイプ1ωWdiE産⽣において，Awat1とAwat2がそれぞれ異なる寄与を⽰すことが明らかになった。

　ヒト涙液中のWdiE組成についてはタイプごとに区別して測定された報告がなかったため，確⽴した測定系を⽤い，ヒト涙液中のWE，OAHFA，タイプ2ωWdiEおよびタイプ1ωWdiEの包括的なLC-MS/MS測定を⾏った。その結果，⼀部の違いはあったものの，鎖⻑分布などはヒト・マウス間で概ね似ていることが明らかになった。

　WEとOAHFAについてはそれぞれA2KOおよびA1KOで消失あるいは⼤きく減少していたことから，Awat2およびAwat1がそれぞれ産⽣を主要に担うことが明らかになった。WdiEについてはタイプ2ωWdiEがA2KOで⼤きく減少し，三価および⼆価不飽和タイプ1ωWdiEがそれぞれA2KOおよびA1KOで⼤きく減少していた。このことから，Awat1およびAwat2がタイプや不飽和度の違うWdiEの産⽣において異なる寄与を⽰すことが明らかになった。マイバム脂質で最も主要なWEが消失したA2KOはマイボーム腺開⼝部の閉塞，マイバム脂質の著しい融点上昇，眼表⾯からの⽔分蒸散の亢進といった激しいマイボーム腺機能不全を⽰した。⼀⽅，OAHFAやタイプ1ωWdiEといった主要ではない分⼦クラスが減少したA1KOもマイボーム腺機能不全を⽰した。したがって，マイバム脂質の多様性を⽣み出すAwat1とAwat2が共にドライアイ防⽌に必須であることが明らかになった。ヒト・マウス間でマイバム脂質の組成が似ていたことから，A1KOやA2KOはマイボーム腺機能不全のモデル動物として有⽤であり，今後の新規治療開発への貢献が期待される。

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