リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「Selective suppression of polyglutamine-expanded protein by lipid nanoparticle-delivered siRNA targeting CAG expansions in the mouse CNS」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

Selective suppression of polyglutamine-expanded protein by lipid nanoparticle-delivered siRNA targeting CAG expansions in the mouse CNS

蛭薙, 智紀 名古屋大学

2021.08.25

概要

【緒言】
ポリグルタミン病はシトシン-アデニン-グアニン(CAG)リピート延長を原因として発症する遺伝性神経変性疾患群の総称であり、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、ハンチントン病、脊髄小脳変性症などの 9 疾患が含まれる。異常延長 CAG リピート由来のポリグルタミン伸長蛋白が細胞内に蓄積し、中枢神経系の特定の領域の神経細胞が変性することが発症の原因と考えられている。例えば SBMA では運動ニューロン、ハンチントン病では大脳基底核や大脳皮質、脊髄小脳変性症では小脳が選択的に障害され、運動機能障害や認知機能障害などの進行性の神経脱落症状を呈する。

原因遺伝子を標的としたアンチセンス核酸(ASO)や低分子干渉 RNA(siRNA)などの核酸医薬を用いてポリグルタミン伸長蛋白を減少させることは、ポリグルタミン病の有力な治療戦略の一つであり、ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン (HTT)を標的とする ASO を用いた臨床試験が現在行われている。CAG リピートを標的とする核酸医薬はもう一つの治療戦略であり、共通するリピート配列を標的とするため、ポリグルタミン病全体に適応可能な治療薬となる可能性がある。しかし、正常な CAG リピートを有する蛋白は中枢神経系において様々な役割を担っており、正常および異常 CAG リピート由来蛋白の同時ノックダウンは神経毒性が生じる可能性がある。近年、CAG リピートを標的とする二本鎖 siRNA(CAG-siRNA)に中央ミスマッチや人工核酸を加えることで、伸長ポリグルタミン蛋白を選択的に発現抑制可能なことが細胞実験レベルで報告されているが、生体内での検証は行われていない。

本研究では CAG リピートに相補的な配列に中央ミスマッチを加え、さらに一部を 人工核酸である unlocked nucleic acid(UNA)に置換した siRNA を新たに作成し、SBMA モデル細胞を用いてポリグルタミン伸長蛋白の発現抑制効果および選択性を検証した。さらに、脂質ナノ粒子を用いて SBMA およびハンチントン病モデルマウスに投与する ことで、同 siRNA の生体内でのポリグルタミン伸長蛋白の発現抑制効果および選択性 を評価した。

【対象及び方法】
本研究ではまず、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより一部の配列を UNA で置換した CAG-siRNA のスクリーニング行なった後、候補 CAG-siRNA を SBMA患者および健常者由来の皮膚線維芽細胞に投与し、ウェスタンブロット法によりポリグルタミン伸長アンドロゲン受容体(AR)および正常 AR に対する抑制効果を検証した。

つぎに、eGFP の mRNA を Lipid-enabled UNA modified RNA(LUNAR®)とよばれる脂質ナノ粒子のデリバリーシステムに抱合(LUNAR-eGFP)した後、新生児マウスの脳室内に投与し、蛍光実態顕微鏡、免疫組織染色およびウェスタンブロット法により eGFP の発現量を評価することで、中枢神経系における LUNAR の分布範囲を検証した。

最後に、線維芽細胞による実験でポリグルタミン伸長 AR 発現を選択的に抑制した CAG-siRNA を LUNAR に抱合し、正常ヒト AR 遺伝子(AR24Q)または CAG リピート延長ヒト AR 遺伝子(AR97Q)を有するトランスジェニックマウスの脳室内に投与し、生体内におけるポリグルタミン伸長 AR 蛋白の発現抑制効果および選択性を評価した。さらに、同 siRNA をハンチントン病モデルマウス(R6/2 マウス)の脳室内および AR97Qマウスの骨格筋にも投与し、ポリグルタミン伸長 HTT および骨格筋におけるポリグルタミン伸長 AR の発現抑制効果も検証した。

【結果】
レポーターアッセイによるスクリーニングで候補となった CAG-siRNA を SBMA 患者および健常者由来の線維芽細胞に投与し、ポリグルタミン伸長 AR に対する抑制効果および選択性を検証した。CAGリピートに完全に相補的な配列を有する siRNA(REP)は、25 nM の濃度において正常 AR およびポリグルタミン伸長 AR のどちらも抑制したのに対し、CAG リピートに相補的な配列に中央ミスマッチおよびアンチセンス鎖の9番目(REPU9)、または9番目と10番目(REPU910)を UNA に置換した CAG- siRNA はポリグルタミン伸長ARを選択的に抑制した (Fig. 1A–C)。特にREPU910は高い選択性を示したことから、同 siRNA を低濃度における効果も検証したところ、REPU910は 2.5–5 nMにおいて正常なARをほとんど抑制せずにポリグルタミン伸長ARを40–65%減少させることが明らかとなった (Fig. 1D and E)。

つぎに LUNAR-eGFP(1800 ng)を生後 1 日のマウス側脳室内に投与し、生後 4 日の時点で中枢神経系での分布範囲を評価したところ、eGFP の発現は嗅球や前頭葉〜側頭葉皮質で高く、視床や小脳では中程度の発現を認めたが、脳幹や脊髄では eGFP の検出が困難であった (Fig. 2)。

最後に、REPU910 を LUNAR に抱合し(LUNAR-REPU910)、生後 1 日の AR97Q および AR24Q マウスの側脳室内に投与し、生後 4 日時点での側頭葉皮質および小脳での AR 蛋白量を評価した。LUNAR-REPU910(1800 ng)は AR97Q マウスの側頭葉皮質および小脳におけるポリグルタミン伸長 AR の発現を、それぞれ 90%および 70%近く抑制したのに対し、AR24Q マウスの側頭葉皮質および小脳における正常 AR の発現をほとんど抑制しなかった (Fig. 3)。さらに、同様に LUNAR-REPU910(1800 ng)を R6/2 マウスの側脳室や AR97Q マウスの骨格筋に投与し、側頭葉皮質におけるポリグルタミン伸長 HTT や、骨格筋におけるポリグルタミン伸長 AR の抑制効果も確認した。

【考察】
本研究では SBMA モデル細胞およびモデルマウスを用いて、UNA の修飾を加えた CAG-siRNA がポリグルタミン伸長 AR を選択的に抑制することを示した。まずレポーターアッセイを用いたスクリーニングにより、高い選択性を示す CAG-siRNA の配列 (REPU910)を新たに同定し、SBMA 患者由来の線維芽細胞を用いてポリグルタミン伸長 AR を選択的に抑制することを確認した。また脂質ナノ粒子により送達された REPU910 はマウス中枢神経系においてポリグルタミン伸長 AR を選択的に抑制することを示した。我々が調べ得た範囲では、本研究は生体内において CAG-siRNA がポリグルタミン伸長蛋白を選択的に抑制することを示した最初の報告である。

本研究では siRNA のノックダウン効果の持続期間や、SBMA の主病巣である下位運動ニューロンにおけるポリグルタミン伸長 AR の発現抑制効果を評価できておらず、薬効時間の評価や中枢神経系での脂質ナノ粒子の分布範囲の拡大が今後の課題となるものの、REPU910 は SBMA の別の治療標的組織である骨格筋や、ハンチントン病モデルマウスの側頭葉皮質においてもポリグルタミン伸長蛋白の発現抑制効果を認め、ポリグルタミン病全体に共通する治療薬となる可能性が示された。

【結論】
本研究により UNA による修飾を加えた CAG-siRNA が、生体内においてもポリグルタミン延長蛋白を選択的に発現抑制することが示され、同 siRNA がポリグルタミン病に共通する治療薬となる可能性が示唆された。

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

1. Kennedy, W.R., Alter, M., and Sung, J.H. (1968). Progressive proximal spinal and bulbar muscular atrophy of late onset. A sex-linked recessive trait. Neurology 18, 671–680.

2. La Spada, A.R., Wilson, E.M., Lubahn, D.B., Harding, A.E., and Fischbeck, K.H. (1991). Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature 352, 77–79.

3. Sahashi, K., and Katsuno, M. (2018). Pathogenesis of Polyglutamine Diseases. Published online October 15, 2018. 101002/9780470015902.a0021486.pub2.

4. Lieberman, A.P., Shakkottai, V.G., and Albin, R.L. (2019). Polyglutamine Repeats in Neurodegenerative Diseases. Annu. Rev. Pathol. 14, 1–27.

5. Wild, E.J., and Tabrizi, S.J. (2017). Therapies targeting DNA and RNA in Huntington’s disease. Lancet Neurol. 16, 837–847.

6. Gonzalez-Alegre, P. (2019). Recent advances in molecular therapies for neurological disease: triplet repeat disorders. Hum. Mol. Genet. 28 (R1), R80–R87.

7. Silva, A.C., Lobo, D.D., Martins, I.M., Lopes, S.M., Henriques, C., Duarte, S.P., Dodart, J.-C., Nobre, R.J., and Pereira de Almeida, L. (2020). Antisense oligonucleo- tide therapeutics in neurodegenerative diseases: the case of polyglutamine disorders. Brain 143, 407–429.

8. Fiszer, A., and Krzyzosiak, W.J. (2014). Oligonucleotide-based strategies to combat polyglutamine diseases. Nucleic Acids Res. 42, 6787–6810.

9. Hu, J., Matsui, M., Gagnon, K.T., Schwartz, J.C., Gabillet, S., Arar, K., Wu, J., Bezprozvanny, I., and Corey, D.R. (2009). Allele-specific silencing of mutant hunting- tin and ataxin-3 genes by targeting expanded CAG repeats in mRNAs. Nat. Biotechnol. 27, 478–484.

10. Gagnon, K.T., Pendergraff, H.M., Deleavey, G.F., Swayze, E.E., Potier, P., Randolph, J., Roesch, E.B., Chattopadhyaya, J., Damha, M.J., Bennett, C.F., et al. (2010). Allele- selective inhibition of mutant huntingtin expression with antisense oligonucleotides targeting the expanded CAG repeat. Biochemistry 49, 10166–10178.

11. Fiszer, A., Mykowska, A., and Krzyzosiak, W.J. (2011). Inhibition of mutant hunting- tin expression by RNA duplex targeting expanded CAG repeats. Nucleic Acids Res. 39, 5578–5585.

12. Hu, J., Liu, J., and Corey, D.R. (2010). Allele-selective inhibition of huntingtin expres- sion by switching to an miRNA-like RNAi mechanism. Chem. Biol. 17, 1183–1188.

13. Liu, J., Pendergraff, H., Narayanannair, K.J., Lackey, J.G., Kuchimanchi, S., Rajeev, K.G., Manoharan, M., Hu, J., and Corey, D.R. (2013). RNA duplexes with abasic sub- stitutions are potent and allele-selective inhibitors of huntingtin and ataxin-3 expres- sion. Nucleic Acids Res. 41, 8788–8801.

14. Aiba, Y., Hu, J., Liu, J., Xiang, Q., Martinez, C., and Corey, D.R. (2013). Allele-selec- tive inhibition of expression of huntingtin and ataxin-3 by RNA duplexes containing unlocked nucleic acid substitutions. Biochemistry 52, 9329–9338.

15. Hu, J., Liu, J., Narayanannair, K.J., Lackey, J.G., Kuchimanchi, S., Rajeev, K.G., Manoharan, M., Swayze, E.E., Lima, W.F., Prakash, T.P., et al. (2014). Allele-selective inhibition of mutant atrophin-1 expression by duplex and single-stranded RNAs. Biochemistry 53, 4510–4518.

16. Sun, X., Marque, L.O., Cordner, Z., Pruitt, J.L., Bhat, M., Li, P.P., Kannan, G., Ladenheim, E.E., Moran, T.H., Margolis, R.L., and Rudnicki, D.D. (2014). Phosphorodiamidate morpholino oligomers suppress mutant huntingtin expression and attenuate neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 23, 6302–6317.

17. Datson, N.A., González-Barriga, A., Kourkouta, E., Weij, R., van de Giessen, J., Mulders, S., Kontkanen, O., Heikkinen, T., Lehtimäki, K., and van Deutekom, J.C.T. (2017). The expanded CAG repeat in the huntingtin gene as target for thera- peutic RNA modulation throughout the HD mouse brain. PLoS ONE 12, e0171127.

18. Kourkouta, E., Weij, R., González-Barriga, A., Mulder, M., Verheul, R., Bosgra, S., Groenendaal, B., Puoliväli, J., Toivanen, J., van Deutekom, J.C.T., and Datson, N.A. (2019). Suppression of Mutant Protein Expression in SCA3 and SCA1 Mice Using a CAG Repeat-Targeting Antisense Oligonucleotide. Mol. Ther. Nucleic Acids 17, 601–614.

19. Liu, C.R., and Cheng, T.H. (2015). Allele-selective suppression of mutant genes in polyglutamine diseases. J. Neurogenet. 29, 41–49.

20. Saudou, F., and Humbert, S. (2016). The Biology of Huntingtin. Neuron 89, 910–926.

21. Rué, L., Bañez-Coronel, M., Creus-Muncunill, J., Giralt, A., Alcalá-Vida, R., Mentxaka, G., Kagerbauer, B., Zomeño-Abellán, M.T., Aranda, Z., Venturi, V., et al. (2016). Targeting CAG repeat RNAs reduces Huntington’s disease phenotype independently of huntingtin levels. J. Clin. Invest. 126, 4319–4330.

22. Snead, N.M., Escamilla-Powers, J.R., Rossi, J.J., and McCaffrey, A.P. (2013). 50 un- locked nucleic acid modification improves siRNA targeting. Mol. Ther. Nucleic Acids 2, e103.

23. Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., and Sobue, G. (2002). Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron 35, 843–854.

24. Mangiarini, L., Sathasivam, K., Seller, M., Cozens, B., Harper, A., Hetherington, C., Lawton, M., Trottier, Y., Lehrach, H., Davies, S.W., and Bates, G.P. (1996). Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87, 493–506.

25. Dragatsis, I., Goldowitz, D., Del Mar, N., Deng, Y.P., Meade, C.A., Liu, L., Sun, Z., Dietrich, P., Yue, J., and Reiner, A. (2009). CAG repeat lengths > or =335 attenuate the phenotype in the R6/2 Huntington’s disease transgenic mouse. Neurobiol. Dis. 33, 315–330.

26. Wang, C.E., Tydlacka, S., Orr, A.L., Yang, S.H., Graham, R.K., Hayden, M.R., Li, S., Chan, A.W.S., and Li, X.J. (2008). Accumulation of N-terminal mutant huntingtin in mouse and monkey models implicated as a pathogenic mechanism in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 17, 2738–2751.

27. Yang, H., Yang, S., Jing, L., Huang, L., Chen, L., Zhao, X., Yang, W., Pan, Y., Yin, P., Qin, Z.S., et al. (2020). Truncation of mutant huntingtin in knock-in mice demon- strates exon1 huntingtin is a key pathogenic form. Nat. Commun. 11, 2582.

28. Lieberman, A.P., Yu, Z., Murray, S., Peralta, R., Low, A., Guo, S., Yu, X.X., Cortes, C.J., Bennett, C.F., Monia, B.P., et al. (2014). Peripheral androgen receptor gene suppres- sion rescues disease in mouse models of spinal and bulbar muscular atrophy. Cell Rep. 7, 774–784.

29. Cortes, C.J., Ling, S.C., Guo, L.T., Hung, G., Tsunemi, T., Ly, L., Tokunaga, S., Lopez, E., Sopher, B.L., Bennett, C.F., et al. (2014). Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron 82, 295–307.

30. Langkjaer, N., Pasternak, A., and Wengel, J. (2009). UNA (unlocked nucleic acid): a flexible RNA mimic that allows engineering of nucleic acid duplex stability. Bioorg. Med. Chem. 17, 5420–5425.

31. Hu, J., Liu, J., Yu, D., Chu, Y., and Corey, D.R. (2012). Mechanism of allele-selective inhibition of huntingtin expression by duplex RNAs that target CAG repeats: func- tion through the RNAi pathway. Nucleic Acids Res. 40, 11270–11280.

32. Ledford, H. (2018). Gene-silencing technology gets first drug approval after 20-year wait. Nature 560, 291–292.

33. Akinc, A., Querbes, W., De, S., Qin, J., Frank-Kamenetsky, M., Jayaprakash, K.N., Jayaraman, M., Rajeev, K.G., Cantley, W.L., Dorkin, J.R., et al. (2010). Targeted de- livery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mecha- nisms. Mol. Ther. 18, 1357–1364.

34. Cullis, P.R., and Hope, M.J. (2017). Lipid Nanoparticle Systems for Enabling Gene Therapies. Mol. Ther. 25, 1467–1475.

35. Rungta, R.L., Choi, H.B., Lin, P.J.C., Ko, R.W.Y., Ashby, D., Nair, J., Manoharan, M., Cullis, P.R., and Macvicar, B.A. (2013). Lipid nanoparticle delivery of sirna to silence neuronal gene expression in the brain. Mol. Ther. Nucleic Acids 2, e136.

36. Shyam, R., Ren, Y., Lee, J., Braunstein, K.E., Mao, H.Q., and Wong, P.C. (2015). Intraventricular delivery of siRNA nanoparticles to the central nervous system. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e242.

37. Helmschrodt, C., Höbel, S., Schöniger, S., Bauer, A., Bonicelli, J., Gringmuth, M., Fietz, S.A., Aigner, A., Richter, A., and Richter, F. (2017). Polyethylenimine Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery to Reduce a-Synuclein Expression in a Model of Parkinson’s Disease. Mol. Ther. Nucleic Acids 9, 57–68.

38. Bartlett, D.W., and Davis, M.E. (2006). Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34, 322–333.

39. Omi, K., Tokunaga, K., and Hohjoh, H. (2004). Long-lasting RNAi activity in mammalian neurons. FEBS Lett. 558, 89–95.

40. Katsuno, M., Tanaka, F., Adachi, H., Banno, H., Suzuki, K., Watanabe, H., and Sobue, G. (2012). Pathogenesis and therapy of spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA). Prog. Neurobiol. 99, 246–256.

41. Sahashi, K., Katsuno, M., Hung, G., Adachi, H., Kondo, N., Nakatsuji, H., Tohnai, G., Iida, M., Bennett, C.F., and Sobue, G. (2015). Silencing neuronal mutant androgen receptor in a mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 24, 5985–5994.

42. Ramaswamy, S., Tonnu, N., Tachikawa, K., Limphong, P., Vega, J.B., Karmali, P.P., Chivukula, P., and Verma, I.M. (2017). Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, E1941–E1950.

43. Onodera, K., Shimojo, D., Ishihara, Y., Yano, M., Miya, F., Banno, H., Kuzumaki, N., Ito, T., Okada, R., de Araújo Herculano, B., et al. (2020). Unveiling synapse pathology in spinal bulbar muscular atrophy by genome-wide transcriptome analysis of purified motor neurons derived from disease specific iPSCs. Mol. Brain 13, 18.

44. Iida, M., Sahashi, K., Kondo, N., Nakatsuji, H., Tohnai, G., Tsutsumi, Y., Noda, S., Murakami, A., Onodera, K., Okada, Y., et al. (2019). Src inhibition attenuates poly- glutamine-mediated neuromuscular degeneration in spinal and bulbar muscular at- rophy. Nat. Commun. 10, 4262.

45. Sahashi, K., Hua, Y., Ling, K.K.Y., Hung, G., Rigo, F., Horev, G., Katsuno, M., Sobue, G., Ko, C.P., Bennett, C.F., and Krainer, A.R. (2012). TSUNAMI: an antisense method to phenocopy splicing-associated diseases in animals. Genes Dev. 26, 1874–1884.

参考文献をもっと見る

全国の大学の
卒論・修論・学位論文
を
一発検索！

この論文の関連論文を見る