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Unveiling synapse pathology in spinal bulbar muscular atrophy by genome-wide transcriptome analysis of purified motor neurons derived from disease specific iPSCs

Onodera, Kazunari 小野寺, 一成 名古屋大学

2020.05.14

概要

【緒言】
　球脊髄性筋萎縮症（Spinal bulbar muscular atrophy, SBMA）は、成人発症の緩徐進行性の運動ニューロン疾患である。アンドロゲン受容体（AR）遺伝子のCAGリピートの伸長が原因で発症する。モデルマウスや細胞モデルの解析により、リガンド（テストステロン）依存的に変異ARが凝集体を形成し、運動ニューロンを変性させることが示されている。しかしモデルマウスと実際の患者には相違があり、根本的な病態メカニズムは未だ不明である。正確な病態の解析・治療法の開発のためには、より正確にSBMA患者の病態を反映する疾患モデルが必要とされてきた。この研究では、SBMA患者からiPS細胞を樹立し、運動ニューロンに分化誘導・純化して、新しい疾患モデルを作成する。さらに網羅的トランスクリプトーム解析を行い、SBMAにおける運動ニューロンの病態を明らかにする。

【対象及び方法】
　4名のSBMA患者と3名の健常者の皮膚線維芽細胞から、エピゾーマルベクターを用いて、OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shTP53を導入し、iPS細胞クローンを複数樹立した（Table1）。樹立したiPS細胞は運動ニューロンに分化誘導し、解析に用いた。運動ニューロン特異的な解析を行うために、運動ニューロン特異的レンチウイルスレポーターHB9e438::Venusに感染させ、4週間培養後、フローサイトメトリーを用いて運動ニューロンを純化した。SBMA患者iPS細胞4クローン、健常者iPS細胞4クローンを用いて、純化前後の運動ニューロンにおいてRNAシークエンスを行い、発現変動遺伝子群（DEGs）の抽出、遺伝子オントロジー（GO）・パスウェイの遺伝子セットを用いたGene set enrichment analysis（GSEA）を行い、SBMAの運動ニューロンにおける病態を探索した。

【結果】
　樹立したiPS細胞は未分化マーカー（Nanog, Oct4）の発現と、奇形腫形成による3胚葉分化（多分化能）により品質評価を行った（Fig. 1）。また、フラグメント解析とサンガーシークエンスにより、樹立したiPS細胞のほとんどの株でAR遺伝子のCAGリピート数が変化していないことを確認した（Fig. 2A）。iPS細胞を運動ニューロンに分化誘導したところ（Fig. 3A）、全ての株で運動ニューロンマーカー（HB9, ISL-1）、成熟マーカー（ChAT, AR）の発現が観察され、運動ニューロンへの分化が確認された（Fig. 3B, C）。　次に、運動ニューロン特異的レンチウイルスレポーターを感染させ、4週間後にフローサイトメトリーを用いて、Venusを高発現するHigh positive fraction（HPF）を分取したところ（Fig. 4A）、運動ニューロンマーカー（HB9, ISL-1, ChAT）はNegative fraction（NF）と比較して有意に高発現し、アストロサイトのマーカー（GFAP）は有意に発現が低下し、健常者と患者でほぼ同等の発現レベルを示したことから、運動ニューロンの純化と分化誘導効率のクローン間差の軽減に成功したと考えられた（Fig. 4B, C）。そこで、SBMA患者・健常者由来運動ニューロン（純化前・後）でRNAシークエンスを行い、DEGsの抽出（Fig.5）、GO・パスウェイ遺伝子セットでGSEAを行ったところ、SBMAにおいて、シナプス、神経伝達物質、エキソサイトーシス、エピジェネティクス関連カテゴリの発現上昇と、小胞体関連カテゴリの発現低下が認められた（Fig. 6A, B, C）。各カテゴリから特に発現の倍率変化の高い遺伝子群に着目すると、シナプス機能に関わる遺伝子群（SYT6, SYT9, RSPO2, WNTs）が抽出され、SBMAの病態にシナプスが深く関わることが示唆された（Fig. 6D）。

【考察】
　SBMAでは、体細胞、生殖細胞におけるAR遺伝子のCAGリピート数にほぼ変化はなく、表現促進現象もまれである。またiPS細胞の樹立過程ではCAGリピート数の変化は認めず、その安定性は患者とよく一致していた。一方でHuntingtin遺伝子のCAGリピート伸長により発症するハンチントン病（HD）や、DMPK遺伝子のCTGリピート伸長により発症する筋強直性ジストロフィー（DM1）では、体細胞におけるリピートの不安定性と表現促進現象が知られているが、iPS細胞の樹立過程において必ずしもリピートの不安定性を示すわけではなく、iPS細胞の樹立と患者におけるリピートの不安定性の相関ははっきりしない。
　RNAシークエンスで有意差のあった遺伝子群には、過去にSBMAの病態への関与が報告されているCALCA、FAM135Bが含まれており、SBMAの疾患モデルとしての再現性が確認された。IGF-1はSBMAモデルマウスや細胞において表現型を改善することが報告されており、NT-3は運動ニューロンの生存を促進し得ることから、SBMA患者由来運動ニューロンでの発現上昇は、代償的なネガティブフィードバック機構によると考えられた。SBMAモデルマウスでは神経筋接合部（NMJ）の病態が示されている。今回のGOやパスウェイ解析では、SBMAでのシナプス関連分子の発現上昇がみられ、NMJの病態への関与が示された。また、グルタミン酸受容体（GRID2, GRIK1, GRM2）や、Gタンパク質共役受容体のシグナルを不活化するRGSタンパク質（RGS4, RGS5）の発現上昇が示され、病態への関与が示唆された。さらに、シナプス小胞の形成に必要不可欠なシナプトタグミン（SYT6, SYT9）、NMJの形成に必要不可欠なアセチルコリン受容体のクラスタリングを促すRSPO2やWNTリガンドの発現上昇、またNMJの形成を抑制的に制御するWNT3Aの発現上昇がみられ、NMJ形成異常の原因となっている可能性が示唆された。これらの変化は、NMJ変性の結果、ネガティブフィードバック機構によりもたらされている可能性も考えられる。これらの結果から、運動ニューロン側からNMJの病態に関与する分子変動が明らかになり、SBMAにおけるNMJ病態の重要性が示唆された。

【結論】
　SBMA患者由来iPS細胞由来運動ニューロンを用いた疾患モデルを作成し、トランスクリプトーム解析により、未だ詳細な検討が行われていないSBMAのシナプス病態が浮き彫りになった。今後はNMJに着目した病態解明や治療法の開発が期待される。

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