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30

10. 図の説明

図 1. 検討 1 のフロー図

内視鏡的に切除した同一標本から大腸正常上皮、大腸腺腫それぞれのオルガノイドを

作成した。培養上清中のエクソソーム miRNA のマイクロアレイ解析によりリキッドバ

イオプシー候補 miRNA を同定した。

図 2. 検討 2 のフロー図

10 mm 以上の大腸腺腫に対して内視鏡治療を行い、内視鏡治療前後の血清・エクソソ

ーム miRNA をリアルタイム PCR で比較した。

図 3. 内視鏡切除標本からのオルガノイドの樹立とエクソソームの分離

A

上段は大腸正常上皮であり、それぞれオルガノイドの光学顕微鏡像 (左)、オルガ

ノイドの H-E 染色 (中央)、内視鏡切除標本の H-E 染色 (右) を示す。下段は大腸腺

腫であり、それぞれオルガノイドの光学顕微鏡像 (左)、オルガノイドの H-E 染色 (中

央)、内視鏡切除標本の H-E 染色 (右) を示す。スケールバーは 100 µm を示す。

B

透過型電子顕微鏡によるエクソソームの観察。大腸正常上皮オルガノイド由来エ

クソソーム（左）、大腸腺腫由来エクソソーム（右）を示す。約 100 nm の類円形の小

胞を確認した。スケールバーは 100 nm を示す。

C

ナノ粒子解析システムによる粒子量の測定。大腸正常上皮オルガノイド由来エク

31

ソソーム（左）、大腸腺腫由来エクソソーム（右）を示す。約 100 nm に最頻値を認め

た。

図 4. 大腸正常上皮・大腸腺腫オルガノイド由来エクソソーム miRNA の網羅的解析

A

バイオアナライザーによる電気泳動の結果。エクソソームから抽出した RNA はリ

ボソーム RNA を含まないことを確認した。

B

エクソソーム miRNA マイクロアレイ解析の結果。大腸正常上皮および大腸腺腫オ

ルガノイド培養上清由来エクソソーム miRNA の発現量を 3 症例の平均値で評価した。

大腸正常上皮群を基準として大腸腺腫群で 15 個の miRNA の発現亢進、97 個の発現低

下を認めた。

図 5. 検討 2 の対象患者の選出

前向きに登録した患者のうち除外基準を有する例を除外し、最終的に 26 症例を対象

とした。

図 6. 内視鏡治療前後での血清エクソソーム miRNA 発現レベルの変化

リアルタイム PCR により内視鏡治療前後の miRNA 発現レベルの比較を行った。血清

エクソソーム miRNA では治療後 miR-4323、miR-4284、miR-1290、miR-1246 の発現レ

ベルが低下した。*は p<0.05 を表す。N.S.: Not Significant。

32

図 7. 内視鏡治療前後での血清 miRNA 発現レベルの変化

同様に血清 miRNA では miR-1290、miR-1246 の発現レベルが低下した 。**は p<0.01

を表す。

図 8. ROC 曲線による診断能の評価

A

血清エクソソーム miR-4323、miR-4284、miR-1290、miR-1246 の AUC 値はそれぞれ

0.637 (95% CI = 0.470-0.776)、0.677 (95% CI = 0.514-0.805)、0.694 (95% CI =

0.534-0.818)、0.635 (95% CI = 0.472-0.772) であった。

B

4 つのエクソソーム miRNA の AUC 値は 0.698 (95% CI = 0.536-0.823)、大きい腫

瘍 (≧12.6cm²)では AUC 値 0.834 (95% CI = 0.660-0.929) であった。

C

血清 miR-1290、miR-1246 の AUC 値はそれぞれ 0.705 (95% CI = 0.544-0.827)、0.639

(95% CI = 0.476-0.776)であった。

D

2 つの血清 miRNA の AUC 値は 0.691 (95% CI = 0.528-0.817)、大きい腫瘍では AUC

値 0.834 (95% CI = 0.628-0.938) であった。

図 9. 候補 miRNA の発現解析

A

各大腸癌細胞株より Total RNA を抽出し miR-4323、miR-4284、miR-1290、miR-1246

の発現量をリアルタイム PCR で比較した。HT-29 細胞を 1 とした場合の相対発現量を

33

示す。

B

大腸癌細胞株 HCT116 細胞に miR-4323、miR-4284、miR-1290、miR-1246 の mimic、

及びそれぞれのコントロールをトランスフェクションし、48 時間後に Total RNA を抽

出した上で発現量を測定した。**は p<0.01 を表す。

図 10. 候補 miRNA 強制発現系における細胞増殖率の評価

大腸癌細胞株 (HCT116 細胞) に候補 miRNA mimic を遺伝子導入し、24 時間毎に MTS

assay により細胞増殖率を測定した。

A

miR-4323 強制発現系の評価。96 時間後で細胞増殖が低下した。

B

miR-4284 強制発現系の評価。細胞増殖能に変化を認めなかった。

C

miR-1290 強制発現系の評価。72 時間後で細胞増殖が亢進した。

D

miR-1246 強制発現系の評価。細胞増殖能に変化を認めなかった。

*は p<0.05 を、**は p<0.01 を表す。

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

表 1. オルガノイドを樹立した患者背景の一覧

年齢

性別

部位

Vienna 分類

1

78

女性

左側結腸

Category 4

2

81

男性

左側結腸

Category 4

3

63

女性

右側結腸

Category 3

45

表 2. マイクロアレイ解析で発現変動がみられたエクソソーム miRNA の一覧

オルガノイド培養上清エクソソーム miRNA (n=3 pairs)

腺腫/正常上皮

正常上皮/腺腫

log 2 FC*

p 値**

log 2 FC*

p 値**

hsa-miR-4323

2.21

0.18

hsa-miR-630

4.71

<0.01

hsa-miR-4284

2.21

0.18

hsa-miR-6087

4.61

<0.01

hsa-miR-1268a

2.06

0.25

hsa-miR-4442

4.23

0.01

hsa-miR-1290

1.41

0.03

hsa-miR-5703

4.11

0.08

hsa-miR-6766-3p

1.29

0.53

hsa-miR-6833-5p

3.47

0.07

hsa-miR-21-5p

0.89

0.70

hsa-miR-711

3.42

<0.01

hsa-miR-1246

0.86

0.09

hsa-miR-7150

3.37

0.08

hsa-miR-2278

0.74

0.63

hsa-miR-6133

3.24

0.08

hsa-miR-3148

0.70

0.75

hsa-miR-4534

3.15

0.18

hsa-miR-595

0.52

0.76

hsa-miR-6865-5p

3.08

0.09

hsa-miR-6775-5p

3.07

0.10

hsa-miR-4716-3p

3.06

0.10

Systematic name

Systematic name

*FC: Fold Change。**対応のある t 検定。

46

表 3. 内視鏡治療前後で血清を採取した患者の臨床的特徴

患者 (n=26)

年齢、n (%)

70 歳未満

13 (50.0)

70 歳以上

13 (50.0)

男性

10 (38.5)

女性

16 (61.5)

右側結腸

19 (73.1)

左側結腸

7 (26.9)

隆起型

3 (11.5)

LST-G

15 (57.7)

LST-NG

8 (30.8)

12.6 cm² 未満

13 (50.0)

12.6 cm² 以上

13 (50.0)

Category 3

14 (53.8)

Category 4

12 (46.2)

性別、n (%)

部位、n (%)

肉眼型、n (%)

腫瘍面積、n (%) *

Vienna 分類、n (%)

LST-G: 側方発育型腫瘍結節顆粒型、LST-NG: 側方発育型腫瘍結節非顆粒型。

*腫瘍面積の中央値 (12.6 cm²) で区分した。

47

表 4. miRNA 高値を示す臨床因子の同定

血清 miR-1290 単変量解析*

高値 (n=13)

p値

多変量解析**

オッズ比

(95%信頼区間)

p値

年齢、n (%)

70 歳未満

6/13 (46.1)

70 歳以上

7/13 (53.8)

1.00

性別、n (%)

男性

5/10 (50.0)

女性

8/16 (50.0)

1.00

部位、n (%)

右側結腸

7/19 (36.8)

左側結腸

6/7 (85.7)

0.07

Reference

5.59

(0.26-118.23)

0.27

肉眼型、n (%)

隆起型

1/3 (33.3)

0.14

Reference

LST-G

10/15 (66.7)

15.6

(0.34-710.67)

0.16

LST-NG

2/8 (25.0)

11.3

(0.15-829.61)

0.27

腫瘍面積、n (%) ***

12.6 cm² 未満

2/13 (15.4)

12.6 cm² 以上

11/13 (84.6)

<0.01

Reference

33.1

(1.97-556.64)

0.02

Vienna 分類、n (%)

Category 3

6/14 (42.9)

Category 4

7/12 (58.3)

0.70

単変量解析で p 値 が 0.2 未満であった臨床因子を多変量解析で解析した。*カイ二乗

検定または Fisher 正確確率検定、**多重ロジスティック回帰分析。***腫瘍面積の中

48

央値は 12.6 cm²である。

49

...