論文の公開元へ糸球体濾過による力学的負荷は、びまん性のポドサイト障害において障害ポドサイトの剥離を促進させる
概要
1-1. 序論
慢性腎臓病（chronic kidney disease: CKD）の患者は世界的に増加し、我が国でも末期腎不全に対する透析患者数の増加による莫大な医療費が問題となっている。腎臓は、糸球体、尿細管、血管、間質からなり、尿の生成を介して生体の恒常性を維持する。尿生成に必要な濾過機能を担うのは糸球体であり（図 1：糸球体の正常構造）、末期腎不全に至るあらゆる病態において、最終的には糸球体機能の荒廃を象徴する糸球体硬化という共通の病理形態所見を呈する。糸球体硬化への進展を防ぐことが、様々な腎臓病研究に共通する課題である。
1-2. ポドサイトの構造と機能
糸球体の濾過障壁は、毛細血管の内側から順に内皮細胞、糸球体基底膜（glomerular basement membrane: GBM）、ポドサイト（臓側上皮細胞）の 3 層構造からなり（図 2：糸球体濾過障壁の 3 層構造）、分子量によるサイズバリアおよび陰性荷電によるチャージバリアによって、体内に必要な蛋白質や血球等を血中に保持しつつ、老廃物や過剰な水分を除去する。血液濾過機構の破綻によって蛋白尿が生じ、蛋白尿が 1 日 3.5 グラムを超えて顕著な低アルブミン血症を来すのがネフローゼ症候群である。蛋白質濾過の制御は GBM が担うと長年考えられてきたが、フィンランド型ネフローゼ症候群の原因遺伝子である NPHS1 (nephrin)の発見を転機に、ポドサイトが主要な役割を担うと考えられるようになった（文献 1）。
ポドサイトは、細胞体とそこから伸びる一次突起、足突起からなる。足突起のみでGBMと接し、細胞体はボウマン腔に浮遊する特殊な構造をもつ（図 3：ポドサイトの正常構造）。隣り合うポドサイトの足突起同士が 30–40 nm の間隙で絡み合い（interdigitation と呼ぶ）、この間隙に形成されるスリット膜（図 2）を介して糸球体濾過障壁の最外層を担う。さらに、 GBM を構成する細胞外基質の産生や、血管内皮増殖因子の分泌を介した内皮細胞の活性維持などにより、糸球体の構造および機能の恒常性維持において重要な役割を担う。
1-3. ポドサイトの障害
あらゆる腎疾患においてポドサイト障害が重要であることが認識され、ポドサイトパチー（podocytopathy）という、びまん性のポドサイト障害に起因する様々な糸球体疾患を包括する分類が提唱された（文献 2–4）。ポドサイトパチーには、ポドサイトが直接の標的となる疾患として、血中に循環する透過性因子による微小変化群（minimal change disease: MCD）/一次性巣状分節性糸球体硬化症（focal segmental glomerulosclerosis: FSGS）や、様々な要因（遺伝子異常、ウイルス感染、薬剤、毒物など）によるポドサイト機能障害に起因する二次性 FSGS が含まれる（文献 5–7）。他にも、IgA 腎症やループス腎炎などの炎症性糸球体疾患で二次的にポドサイトが障害されるものも含まれ、これらにおいては、原疾患の機序とは異なり、ポドサイト障害により糸球体障害が進展する（文献 8–10）。
1-4. ポドサイト喪失と分節性糸球体硬化
原疾患を問わず、障害を受けたポドサイトの最終的な転帰は、糸球体からの脱落による喪失である。ポドサイトパチーの代表疾患である一次性 FSGS だけでなく、IgA 腎症や糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症などでもポドサイト数あるいは密度の減少が報告され、ポドサイト数と蛋白尿、糸球体濾過量に相関があるとされている（文献 8）。
ポドサイトの喪失が致命的であるのは、それが糸球体硬化の起点となるからである。糸球体硬化は糸球体障害の終末像であり、ポドサイト障害がその主要な誘因であることは広く知られるが（文献 11–15）、ポドサイト障害単独では糸球体硬化に至るに不十分である。糸球体からのポドサイト喪失とそれに続く一連の反応、すなわち、ポドサイト喪失により露出したGBM を被覆する壁側上皮細胞（parietal epithelial cell: PEC）の活性化と遊走や、ポドサイトが喪失した係蹄腔内への泡沫細胞浸潤、血栓形成などが硬化病変形成において重要であることが、ヒトの腎生検標本あるいは実験動物を用いた研究によって明らかにされてきた（文献 14,16–19、図 4：ポドサイト喪失部位に起こる一連の反応）。ポドサイトは終末分化細胞であり再生能を持たないため、ポドサイト喪失からの一連の過程は、不可逆性変化として進行する。したがって、ポドサイト喪失の機序を解明し、ポドサイト数・密度の減少を防ぐことが、腎疾患の進行抑制において重要である。
ポドサイト喪失の機序を理解するうえで注目すべきは、その結果として起こる糸球体硬化病変が分節性に形成される傾向があることである。機能ネフロン数の減少等に伴う過剰濾過の病態で起こる二次性 FSGS では、ポドサイトは血行力学的に障害されるが、糸球体硬化は分節性病変として血管極付近に生じることが多い（文献 20,21、図 5：血管極付近の糸球体硬化）。この特徴的な病変局在は、血管極付近のポドサイトが脆弱であることに起因し、ポドサイトと PEC の接着が弱いことや、輸入細動脈において静水圧が高く、強い力学的負荷がかかることがその脆弱性を生み出していると考えられている（文献 22）。すなわち、ポドサイト障害自体が血管極付近という局所で起こり、結果としてその局所においてポドサイトが喪失すると考えられる。一方、一次性 FSGS に代表されるポドサイトパチーにおいて、ポドサイトがびまん性に障害される場合でも、糸球体硬化は分節性病変として生じる。ポドサイト喪失がその局所での分節性糸球体硬化につながることを想起すると、びまん性のポドサイト障害において硬化病変が分節性に起こる背景には、硬化の起点となるポドサイト喪失が局所病変として生じる性質があるのではないかと考えられる。この局在の性質は、ポドサイト喪失の機序を解明するうえで重視すべきであると我々は考える。
1-5. ポドサイト喪失機序に関する既存研究
上述の通りポドサイト喪失は分節性糸球体硬化の起点となる重要な病変であるが、ポドサイトが糸球体から喪失する機序は明らかになっていない。
i) 細胞死か剥離か？
細胞死は、臓器からの細胞の喪失の原因として一般的に考えやすいが、少なくとも、アポトーシスによる細胞死はポドサイト喪失の主要因ではないと考えられている。ポドサイトのアポトーシスは in vitro の実験系あるいは in vivo でも caspase 3 や TUNEL 染色によって示されるのみで、数多の組織観察においてポドサイトのアポトーシスはほとんど観察されない（文献 23）。その一方で、核の保たれたポドサイトが、細胞間ジャンクションをつくり集塊をなして剥離する様が、Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)によるポドサイト障害モデルの組織や、ポドシン（ポドサイトスリット膜の構成蛋白）を GFP で標識したマウスの二光子顕微鏡での観察などで示されている（文献 24,25、図 6：集塊をなして剥離する核の保たれたポドサイト）。さらに、尿中ポドサイトは培養可能であるとの報告が相次いでなされ（文献 26–29）、ポドサイトは生きた細胞の状態で糸球体基底膜から「剥離」することで喪失すると考えられるようになった。Anoikis やオートファジー、mitotic catastrophe など他の様態の細胞死がポドサイト喪失に関連する可能性はあり、研究がされているが、本研究では、ポドサイトの「剥離」に着目して検討を行った。
ii) 細胞接着に関わる分子異常
ポドサイトを含む糸球体濾過障壁の構造と機能は、細胞・細胞間および細胞・基質間の接着によって保たれており、ポドサイトの GBM への接着は、integrin や dystroglycan など、細胞骨格のアクチンと相互作用するいくつかの受容体によって維持されている（図 7：ポドサイト-GBM の接着に関連する分子）。したがって、接着に関連する分子に生じる異常がポドサイト剥離の原因となる可能性は十分に考えられる。ポドサイト足突起に発現する α3β1 integrin は、GBM のラミニンをリガンドとし、ポドサイト細胞内のアクチン細胞骨格と連関 してポドサイト–GBM の接着に重要な役割を担う（文献 30,31、図 7）。ヒトおよびラットの 糖尿病性腎症において α3β1 integrin の発現が減少していること（文献 32,33）や、この integrin を強制的に欠損させたマウスで顕著な足突起消失を呈すること（文献 34）が知られている。 また、α3β1 integrin とアクチンの相互作用においては、ポドサイトのアクチン細胞骨格を構 成する蛋白質であるタリン-1 が共同して作用しており、タリン-1 の欠損によって顕著な足 突起消失を伴う蛋白尿を生じることが報告されている（文献 35,36）。これらの研究によっ て、接着に関連する分子群の異常がポドサイトおよび糸球体の恒常性破綻や蛋白尿に関連 することが示されるが、in vivo の生体内現象としてのポドサイト剥離そのものとの因果関 係は評価されていない。また、分子の発現変化は細胞障害そのものを示すのではなく、あく までも、障害刺激に対してポドサイトおよび糸球体が反応する過程で付随的に生じる変化 である。したがって、剥離の最終局面で何らかの分子学的機構が関わる可能性はあるものの、びまん性のポドサイト障害において分節性に剥離が生じる機序を理解するためには、その 分子学的機構を起こすに至らせる刺激は何か、それに対しポドサイトや糸球体はどのよう に反応するのか、という視点で、in vivo での現象を解析する必要がある。
iii) ポドサイト剥離と機械的ストレス
障害刺激と細胞応答の観点から、ポドサイト剥離の機序として盛んに論じられてきたのは、機械刺激の関連である。ポドサイトを含めて、細胞は、生体内外で生じる様々なストレス因子に常に晒されている。生理的なストレスは、それに対する細胞の適応能力を高める意義があるが、ストレスが過剰あるいは長期間持続して細胞の適応限界を超えると、細胞は障害される。ポドサイトが受ける細胞障害ストレスとして、機械的ストレス、酸化ストレス、小胞体ストレス、炎症、毒素などが挙げられるが、中でも、ポドサイトは濾過経路において GBMの下流に位置するため、血行力学的な負荷に曝され、持続的な機械的ストレスを受けるのが特徴である。ポドサイトが in vivo で直面する主要な機械的ストレスは、細胞の伸長による引張力と、ずり応力である（文献 37,38）。細胞の伸長は、過剰濾過や高血圧によって GBMが引き伸ばされることによって起こり（文献 38,39）、ずり応力は、係蹄腔からボウマン腔への濾液の流れによってスリット膜レベルで受ける他、ボウマン腔内で、尿細管極側へ向かう原尿の流れによってポドサイト細胞体の表面が受ける（文献 37,40,41、図 8：ポドサイトが受けるずり応力）。ずり応力も、細胞の伸長と同様、糸球体過剰濾過の状況で助長される。高血圧や糖尿病など糸球体高血圧、過剰濾過を引き起こす全身病態において、これらの機械的ストレスがポドサイトを剥離に進展させると推測されてきた（文献 38）。
ポドサイトは伸長やずり応力を受けながらもその構造と機能を維持するためにアクチン細胞骨格を持っており、伸長したポドサイトはアクチンの再構築を起こすことが示されている（文献 42,43,44）。また、ACTN4, INF2, MYO1E など、アクチン細胞骨格に関連する遺伝子の異常によってポドサイトは機械刺激に対して脆弱となり、FSGS を来すことが知られている（文献 45–52）。さらに、機械刺激を受けたポドサイトでは、生化学的な反応として、細胞内 Ca 濃度の増加やアンギオテンシン II の分泌の増加などが起こるとされる（文献 43,53,54）。これらのポドサイト細胞骨格を担う分子と機械的ストレスとの関連についての報告はいずれも in vitro の実験系に基づくものであり、先述の接着関連分子と同様、生体内現象としてのポドサイト剥離との因果関係は明確にされていない。
機械的ストレスに着目した in vivo でのポドサイト障害および剥離の形態学的な検討として、Kriz らは、FGF-2 刺激等により機械的ストレスを受けたポドサイトが剥離に至る過程を電子顕微鏡写真の詳細な観察をもとに推察している。彼らは、障害を受けたポドサイトの形態変化として、細胞体の菲薄化と subpodocyte space (SPS)の拡大を伴う細胞の肥大、細胞内物質のターンオーバー亢進（ライソゾームやオートファゴソームの増加）、足突起消失などが生じるとし（図 9：障害ポドサイトに起こる形態変化）、障害ポドサイトが剥離に至る過程で足突起消失が重要な病変であるとした。足突起消失は、スリット膜の構造を occluding junction に置き換え、アクチン細胞骨格の再構成によって足突起をなくし細胞体が直接 GBMに接するようになる変化であるが、彼らはこれを、障害ポドサイトが細胞・細胞間および細胞・基質間の接着能を高めて剥離に抗う防御反応であるとした。そして、この構築変化を基盤に、糸球体濾過を介してポドサイトに垂直方向にかかる静水圧（図 8 の上段に相当）が、ポドサイトをボウマン腔へ向けて押し出す形で、剥離を惹起および助長すると提唱している（文献 23,24,38、図 9）。
1-6. 本研究の目的
Kriz らによるポドサイト剥離過程の推察は詳細な電顕観察に基づき、障害を受けたポドサイトが機械的ストレスにより生きた細胞として剥離する過程の説明として、理にかなった推察であると考えられる。しかし、足突起消失と剥離の関連性について定量的な解析はされておらず、我々が着目する、剥離の糸球体内での局在を生み出す要因についても明確にされていない。さらに、糸球体濾過とポドサイト剥離との関連性についても、過剰濾過や糸球体肥大といった、機械的ストレスが正常よりも強くかかる状態での観察結果に基づいており、正常レベルの糸球体濾過が障害ポドサイトの剥離を助長する因子であるのかどうかは不明である。
今回、我々は、力学的負荷、特にスリット膜を通過する濾液による負荷が障害ポドサイトの剥離を促進させるという発想を基盤とし、糸球体濾過は、それが正常レベルであっても障害ポドサイトの剥離を助長する因子であるのかどうかを、in vivo でのポドサイト剥離の形態学的かつ定量的な解析によって明らかにすることを目的と定めた。特に、びまん性ポドサイト障害において剥離が分節性に生じる性質について探求するため、本研究では、ポドサイトがびまん性かつ均等、一斉に障害される性質をもつ NEP25 マウスを用いて検討を行った。
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