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きのこを腐敗させる毒素tolaasinに対するMicrobacterium属細菌による解毒機構

富田 駿 東京農業大学

2021.09.22

概要

研究背景
きのこ腐敗病はPseudomonas tolaasiiを病原菌とする細菌病であり，広範な食用きのこに対して，子実体の褐変・腐敗を生じることから，国内外の原木および菌床きのこ栽培における重要病害である。P.tolaasiiが分泌生産するtolaasinは，本病害の毒素成分として知られており，病徴を引き起こす原因物質として同定されている。Tolaasinはオクタデカペプチドとβ-ヒドロキシオクタン酸から構成され，Thr14残基の水酸基とLys18のカルボキシ基がエステル結合した環状構造を形成する環状リポペプチド（以下，cLP）である。

国内では，きのこ細菌病全般に対する登録農薬はなく，その防除には栽培環境の管理が唯一の策となっているため，野外で栽培を行う原木栽培ではその管理がままならない状況にある。一方で，環境影響負荷が小さく収穫間際の子実体に対しても施用できるなどの利点から，本病害に対しては生物農薬の開発が期待されており，これまでに本病害に対して防除活性を示す微生物株の探索が世界各国で行われてきた。本病害の生物防除を目的とした研究事例には，病原菌P.tolaasiiに対して生育阻害活性を示す拮抗微生物やバクテリオファージの選抜や機能解析が散見されるが，実用化には至っていない。

共同研究者の篠原は，本病害に対する新たな生物防除戦略として，tolaasinの無毒化による生物防除法を考案し，健全なシイタケ子実体を分離源としてtolaasin解毒活性を示す数種の有用菌株を分離した。実用的な生物農薬の開発には，病害抑制効果をより高めるために，その有用生物の病害抑制機構を理解することが必要となる。そこで本研究では，有用分離菌株の中でも，とりわけ高いtolaasin解毒能を示したMicrobacterium属細菌について，tolaasin解毒機構を解析した。

１.Microbacteriumsp.K3-5によるtolaasin解毒機構
Microbacteriumsp.K3-5（以下，K3-5）は，シイタケ子実体から分離されたtolaasin解毒菌株である。K3-5培養液へtolaasinを添加すると，上清中のtolaasinを高効率に除去する。本菌のtolaasin除去機構を明らかにするため，K3-5培養液を菌体懸濁液と培養上清に分け，各々のtolaasin除去活性を評価した。K3-5のtolaasin除去活性は菌体懸濁液のみに認められ，培養上清には活性が認められなかった。そして，菌体懸濁液処理後の上清をLC-MSMSにより分析したところ，tolaasinの分子内環状構造となるThr14残基の水酸基とLys18のカルボキシ基間のエステル結合を加水分解し，開環した生成産物が同定された。K3-5菌体処理によるtolaasin解毒能をジャガイモ塊茎切片の褐変化およびエノキタケ(Flammulinavelutipes)に対する抗真菌活性を指標とした生物検定により評価したところ，顕著な解毒効果が確認された。以上の結果から，K3-5のtolaasinの解毒機構は，K3-5菌体でtolaasinを加水分解し，生成産物を上清へ移行することを特定した。cLPの生分解については，surfactin及びdaptomycinについて，各々，Streptomyces属による機構が報告されており，何れも分泌型の加水分解酵素による環状構造の開環による抗菌活性の消失が挙げられる。K3-5のtolaasin解毒機構は，既報の他のcLP分子種の生分解様式と類似するが，分泌型ではなく，K3-5菌体にのみ活性が認められる新規のcLP生分解様式であった。

2．Microbacterium属基準菌株によるtolaasin解毒特性比較
Microbacterium属基準株について，前項の実験方法に従い，tolaasin解毒活性を評価した。基準株30菌株は，K3-5と同様に，何れの菌株も培養上清にtolaasin解毒活性は認められなかった。一方で，何れの菌株も培養菌体にtolaasin除去能が認められた。しかし，tolaasin処理した菌体を，きのこ子実体の褐変を指標とした生物検定により解毒能を評価すると，供試した基準菌株の中で，M.foliorumNBRC103072Tを除く，全ての菌株でtolaasin処理菌体に毒素活性が認められた。さらに，tolaasin解毒能を示さないM.paraoxydansNBRC103076Tについて，tolaasin処理した菌体を１MNaClもしくはメタノールで抽出したところ，抽出液中にtolaasinが検出された。このことは，tolaasin吸着能はMicrobacterium属に広く分布するが，tolaasinの解毒には不十分であることを明らかにした。一方，tolaasin解毒能を示すM.foliorumNBRC103072Tのtolaasin処理菌体からは，tolaasinは回収されなかった。さらに，K3-5で明らかにしたtolaasinの開環による分解生成産物は検出されなかったことから，M.foliorumNBRC103072Tのtolaasin解毒機構は新規性が高いことが強く示唆された。

3.Microbacterium foliorumNBRC103072Tのtolaasin解毒様式
M.foliorumNBRC103072Tのtolaasin解毒機構を解析した。M.foliorumNBRC103072T菌体へtolaasinを処理し，その上清をLC-MS/MSで解析したところ，tolaasinのSer6とLeu7間，もしくはVal5とSer6間のペプチド結合を加水分解した4種類の生成産物が検出され，M.foliorumNBRC103072Tは，前述のK3-5とは異なる，特異的なtolaasin生分解様式によりtolaasinを解毒することを明らかにした。さらに，本菌の培養菌体の0.5%TritonX-100抽出液中には，同様のtolaasin分解活性が検出された。菌体からのゲノムDNA溶出量から，界面活性剤処理を行っても細胞構造を維持していることが予想され，tolaasin加水分解酵素は菌体の表層付近に局在することが示唆された。以上の結果から，M.foliorumNBRC103072Tのtolaasin解毒機構は，cLPのペプチド鎖内部の特異的なペプチド結合を加水分解する新規の生分解様式によることを明らかにした。

4.Microbacterium foliorum NBRC103072Tのtolaasin生分解の特徴
前項でtolaasin分解活性が認められたM. foliorum NBRC103072T菌体の0.5%TritonX-100抽出液ならびに菌体懸濁液のtolaasin分解特性を比較した。各試料へtolaasinを添加し，上清中のtolaasin残存量と分解産物の生成量を経時的に解析したところ，抽出液中のtolaasinは分解産物の生成量に反比例して直線的に減少したのに対し，菌体懸濁液の上清中のtolaasinは，分解産物の生成量に反比例せずに，添加後速やかに減少した。また，両試料のtolaasinの除去及び分解産物の生成に対するpHの影響を比較したところ，抽出液では，tolaasin除去と分解産物の生成は同じ挙動を示し，pH4及び5で最も低く，pH9で最も高い値を示した。一方で菌体懸濁液では，tolaasin除去と分解産物の生成は抽出液とおよそ同様の傾向を示すものの，pH4において，分解産物は検出されないが，tolaasin除去能は認められた。これらの結果は，本菌の菌体では，tolaasinの加水分解に先立ち，tolaasinが菌体へ吸着することを示した。そして本菌の高効率なtolaasinの解毒は，菌体表面に未同定のtolaasin結合因子が存在し，効率的にtolaasinを菌体へ吸着した後に，菌体表層に局在するtolaasin分解酵素によって成し遂げられることが示唆された。

5．Microbacterium foliorum NBRC103072Tのtolaasin分解酵素の推定
M.foliorumNBRC103072Tのtolaasin分解酵素の同定を目的として，tolaasin分解活性を指標に酵素を精製し，ペプチドマッピングを行った。培養菌体の0.5%TritonX-100抽出液を，陰イオン交換及び疎水性クロマトグラフィーによりtolaasin分解活性画分を精製した。得られた粗精製物を，BlueNative-PAGEへ供し，泳動後のゲルのtolaasin分解活性を評価したところ，140～240kDa付近にtolaasin分解活性が検出された。ゲルを切り出し，トリプシンによるゲル内消化後，LC-MS/MSによりペプチドマッピングを行った。得られたペプチド断片のアミノ酸配列から，タンパク質を探索（MASCOTサーチ）したところ数種のタンパク質が同定され，その中でプロテアーゼとしての働きを持つものはAminopeptidaseNのみであった。以上の結果より，M.foliorumNBRC103072Tのtolaasin分解酵素として，AminopeptidaseNを推定した。今後は，本酵素の遺伝子破壊株の作出や組換えタンパク質を作製し，tolaasin分解酵素の同定を行うとともに，その性状を明らかにする必要がある。

総括
本研究では，きのこ腐敗病の毒素因子tolaasinの解毒を戦略とした生物防除を目的として，tolaasin解毒能を示すMicrobacterium属細菌のtolaasin解毒機構を明らかにした。そして，本属の特定の菌株に見出されたtolaasin解毒能は，既報のcLP生分解様式とは異なり，①tolaasin加水分解酵素は分泌されず，菌体に存在すること，②菌株によって触媒部位が異なり，中でも③cLPのペプチド鎖の内部を分断する活性を示す菌株が存在することなどの新規の知見により成し遂げられることを明らかにした。併せて，本属に共通した菌体への高いtolaasin吸着能は，tolaasinの菌体への吸着のみでは解毒に不十分であるが，菌体でtolaasinを加水分解する解毒菌にとっては，tolaasinの解毒を高効率なものとすることを明らかにした。有用微生物を利用した植物病害の生物防除については，詳細な病害抑制機構の解明が，より効果的な生物防除法を企てる上での礎となる。例えば，本研究で得られた成果として，本属のtolaasin解毒にはtolaasin加水分解活性が鍵となる知見から，病害抑制に必要な酵素活性量を推定し，指標とすることで，本属菌株を応用した微生物製剤の散布法や散布時期などの最適化を図ることが可能となるであろう。将来，本研究の成果をもとに，生物防除剤を利用した安定的なきのこ栽培法が確立され，きのこ産業の発展に貢献することを期待する。

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白田 昭, 菅谷和寿, 高杉光雄, 門出健次 (1995). 栽培ヒラタケに腐敗病を起こす日本産 Pseudomonas tolaasii の産生する毒素とその生物活性.日本植物病理学会報，61, 493-502

横田健治, 七海隆之, 富田駿, キム オッキョン, 根岸寛光, 篠原弘亮 (2018). 栽培シイタケの細菌叢解析とトラシン解毒細菌の分離およびPseudoxanthomonas 属細菌のトラシン解毒機作. 日本きのこ学会誌, 25 (4),129–133.

Bassarello, C., Lazzaroni, S., Bifulco, G., Lo Cantore, P., Iacobellis, N. S., Riccio, R., Gomez-Paloma, L., & Evidente, A. (2004). Tolaasins A-E, five new lipodepsipeptides produced by Pseudomonas tolaasii. Journal of Natural Products, 67(5), 811–816. https://doi.org/10.1021/np0303557

Behrendt, U., Ulrich, A., & Schumann, P. (2001). Description of Microbacterium foliorum sp. nov. and Microbacterium phyllosphaerae sp. nov., isolated from the phyllosphere of grasses and the surface litter after mulching the sward, and reclassification of Aureobacterium resistens (Funke et al. 1998) as Microbacterium resistens comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51(4). https://doi.org/10.1099/00207713-51-4-1267

Brennan, N. M., Brown, R., Goodfellow, M., Ward, A. C., Beresford, T. P., Vancanneyt, M., Cogan, T. M., & Fox, P. F. (2001). Microbacterium gubbeenense sp. nov., from the surface of a smear-ripened cheese. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51(6). https://doi.org/10.1099/00207713-51-6-1969

Britton, H. T. H., and R. R. A. (1931). Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal. J. Chem. Soc, 1456–1462.

Brodey, C. L. (1991). Bacterial Blotch Disease of the Cultivated Mushroom Is Caused by an Ion Channel Forming Lipodepsipeptide Toxin. In Molecular Plant-Microbe Interactions (Vol. 4, Issue 4, p. 407). https://doi.org/10.1094/MPMI-4-407

D’Costa, V. M., Mukhtar, T. A., Patel, T., Koteva, K., Waglechner, N., Hughes, D. W., Wright, G. D., & De Pascale, G. (2012). Inactivation of the lipopeptide antibiotic daptomycin by hydrolytic mechanisms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(2), 757–764. https://doi.org/10.1128/AAC.05441-11

Han, H. S., Jhune, C. S., Cheong, J. C., Oh, J. A., Kong, W. S., Cha, J. S., & Lee, C. J. (2012). Occurrence of black rot of cultivated mushrooms (Flammulina velutipes) caused by Pseudomonas tolaasii in Korea. European Journal of Plant Pathology, 133(3), 527–535. https://doi.org/10.1007/s10658-012-9941-4

Hoefler, B. C., Gorzelnik, K. V., Yang, J. Y., Hendricks, N., Dorrestein, P. C., & Straight, P. D. (2012). Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(32), 13082–13087. https://doi.org/10.1073/pnas.1205586109

Imai, K., Takeuchi, M., & Banno, I. (1984). Reclassification of “Flavobacterium arborescens” (Frankland and Frankland) Bergey et al. in the genus Microbacterium (Orla-Jensen) Collins et al., as Microbacterium arborescens comb. nov., nom. rev. Current Microbiology, 11(5). https://doi.org/10.1007/BF01567386

Jo, G., Hwang, D., Lee, S., Woo, Y., Hyun, J., Yong, Y., Kang, K., Kim, D. woon, & Lim, Y. (2011). In silico study of the ion channel formed by tolaasin i produced by pseudomonas tolaasii. Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(10), 1097– 1100. https://doi.org/10.4014/jmb.1103.03026

Kageyama, A., Matsuo, Y., Kasai, H., Shizuri, Y., Omura, S., & Takahashi, Y. (2008). Microbacterium awajiense sp. nov., Microbacterium fluvii sp. nov. and Microbacterium pygmaeum sp. nov. Actinomycetologica, 22(1). https://doi.org/10.3209/saj.saj220101

Kageyama, A., Takahashi, Y., Matsuo, Y., Adachi, K., Kasai, H., Shizuri, Y., & Omura, S. (2007). Microbacterium flavum sp. nov. and Microbacterium lacus sp. nov., isolated from marine environments. Actinomycetologica, 21(2). https://doi.org/10.3209/saj.saj210201

Kageyama, A., Takahashi, Y., Matsuo, Y., Kasai, H., Shizuri, Y., & Omura, S. (2007).

Microbacterium sediminicola sp. nov. and Microbacterium marinilacus sp. nov., isolated from marine environments. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57(10). https://doi.org/10.1099/ijs.0.65038-0 Kageyama, A., Takahashi, Y., & Omura, S. (2006). Microbacterium deminutum sp. nov.,

Microbacterium pumilum sp. nov. and Microbacterium aoyamense sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(9). https://doi.org/10.1099/ijs.0.64236-0 Laffineur, K., Avesani, V., Cornu, G., Charlier, J., Janssens, M., Wauters, G., & Delmée, M. (2003). Bacteremia due to a novel Microbacterium species in a patient with leukemia and description of Microbacterium paraoxydans sp. nov. Journal of Clinical Microbiology, 41(5). https://doi.org/10.1128/JCM.41.5.2242-2246.2003

Matsuyama, H., Kawasaki, K., Yumoto, I., & Shida, O. (1999). Microbacterium kitamiense sp. nov., a new polysaccharide-producing bacterium isolated from the wastewater of a sugar-beet factory. International Journal of Systematic Bacteriology, 49(4). https://doi.org/10.1099/00207713-49-4-1353

Nguyen, H. T. D., Yoon, S., Kim, M. H., Kim, Y. K., Yoon, M. Y., Cho, Y. H., Lim, Y., Shin, S. H., & Kim, D. E. (2012). Characterization of bacteriophage ϕPto-bp6g, a novel phage that lyses Pseudomonas tolaasii causing brown blotch disease in mushrooms. Journal of Microbiological Methods, 91(3), 514–519. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2012.09.032

Nutkins, J. C., Mortishire-Smith, R. J., Williams, D. H., Packman, L. C., Brodey, C. L., Rainey, P. B., & Johnstone, K. (1991). Structure Determination of Tolaasin, an Extracellular Lipodepsipeptide Produced by the Mushroom Pathogen Pseudomonas tolaasii Paine. Journal of the American Chemical Society, 113(7), 2621–2627. https://doi.org/10.1021/ja00007a040

Osdaghi, E., Martins, S. J., Ramos-Sepulveda, L., Vieira, F. R., Pecchia, J. A., Beyer, D. M., Bell, T. H., Yang, Y., Hockett, K. L., & Bull, C. T. (2019). 100 years since Tolaas: Bacterial blotch of mushrooms in the 21st century. Plant Disease, 103(11), 2714–2732. https://doi.org/10.1094/PDIS-03-19-0589-FE

Pent, M., Põldmaa, K., & Bahram, M. (2017). Bacterial communities in boreal forest mushrooms are shaped both by soil parameters and host identity. Frontiers in Microbiology, 8(MAY), 1–13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00836 Sahin, N. (2005). Antimicrobial activity of Streptomyces species against mushroom blotch disease pathogen. Journal of Basic Microbiology, 45(1), 64–71. https://doi.org/10.1002/jobm.200410427

Sajben-Nagy, E., Maróti, G., Kredics, L., Horváth, B., Párducz, Á., Vágvölgyi, C., & Manczinger, L. (2012). Isolation of new Pseudomonas tolaasii bacteriophages and genomic investigation of the lytic phage BF7. FEMS Microbiology Letters, 332(2), 162–169. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2012.02592.x

Schippers, A., Bosecker, K., Spröer, C., & Schumann, P. (2005). Microbacterium oleivorans sp. nov. and Microbacterium hydrocarbonoxydans sp. nov., novel crudeoil-degrading Gram-positive bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55(2). https://doi.org/10.1099/ijs.0.63305-0

Schleifer, K. H., Hayn, I., Seidl, H. P., & Firl, J. (1983). Threo-β-hydroxyornithine: A natural constituent of the peptidoglycan of Corynebacterium species Co 112. Archives of Microbiology, 134(3). https://doi.org/10.1007/BF00407766

Schumann, P., Rainey, F. A., Burghardt, J., Stackebrandt, E., & Weiss, N. (1999). Reclassification of Brevibacterium oxydans (chatelain and second 1966) as Microbacterium oxydans comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 49(1). https://doi.org/10.1099/00207713-49-1-175

Soler-Rivas, C., Möller, A. C., Arpin, N., Olivier, J.-M., & Wichers, H. J. (2001). Induction of a tyrosinase mRNA in Agaricus bisporus upon treatment with a tolaasin preparation from Pseudomonas tolaasii. Physiological and Molecular Plant Pathology, 58(2), 95–99. https://doi.org/10.1006/PMPP.2000.0312

Splivallo, R., Deveau, A., Valdez, N., Kirchhoff, N., Frey-Klett, P., & Karlovsky, P. (2015). Bacteria associated with truffle-fruiting bodies contribute to truffle aroma. Environmental Microbiology, 17(8), 2647–2660. https://doi.org/10.1111/1462-2920.12521

Steinhaus, E. A. (1941). A Study of the Bacteria Associated with Thirty Species of Insects. Journal of Bacteriology, 42(6). https://doi.org/10.1128/jb.42.6.757-790.1941

Takeuchi, M., & Hatano, K. (1998a). Proposal of six new species in the genus Microbacterium and transfer of Flavobacterium marinotypicum ZoBell and Upham to the genus Microbacterium as Microbacterium maritypicum comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 48(3). https://doi.org/10.1099/00207713-48-3-973

Takeuchi, M., & Hatano, K. (1998b). Union of the genera Microbacterium Orla-Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redefined genus Microbacterium. International Journal of Systematic Bacteriology, 48(3). https://doi.org/10.1099/00207713-48-3-739

Thorn, G. (1996). Molecular genetic characterization of bacterial isolates causing brown blotch on cultivated mushrooms in Japan. Mycoscience, 37(4), 409–416. https://doi.org/10.1007/BF02460997

Tsukamoto, T., Murata, H., & Shirata, A. (2002). Identification of Non-Pseudomonad Bacteria from Fruit Bodies of Wild Agaricales Fungi That Detoxify Tolaasin Produced by Pseudomonas tolaasii. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66(10), 2201–2208. https://doi.org/10.1271/bbb.66.2201

Tsukamoto, T., Takeuchi, M., Shida, O., Murata, H., & Shirata, A. (2001). Proposal of Mycetocola gen. nov. in the family Microbacteriaceae and three new species, Mycetocola saprophilus sp. nov., Mycetocola tolaasinivorans sp. nov. and Mycetocola lacteus sp. nov., isolated from cultivated mushroom, Pleurotus ostreatus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51(3). https://doi.org/10.1099/00207713-51-3-937

Tsukamoto, Takanori. (1998). Isolation of a Gram-positive bacterium effective in suppression of brown blotch disease of cultivated mushrooms, Pleurotus ostreatus and Agaricus bisporus, caused by Pseudomonas tolaasii. Mycoscience, 39(3). https://doi.org/10.1007/BF02464008

Tsukamoto, Takanori, Murata, H., & Shirata, A. (2002). Identification of NonPseudomonad Bacteria from Fruit Bodies of Wild Agaricales Fungi That Detoxify Tolaasin Produced by Pseudomona. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 66(10), 2201–2208. https://doi.org/10.1271/bbb.66.2201

Woude, A. D. Van Der, Mahendran, K. R., Ummels, R., Piersma, R., Pham, T. V, Punder, K. De, Wel, D., Winterhalter, M., Luirink, J., Bitter, W., & Edith, N. G. (n.d.). channel activity.

Yang, X., Huang, E., & Yousef, A. E. (2017). Brevibacillin, a cationic lipopeptide that binds to lipoteichoic acid and subsequently disrupts cytoplasmic membrane of Staphylococcus aureus. Microbiological Research, 195, 18–23. https://doi.org/10.1016/j.micres.2016.11.002

Yokota, A., Takeuchi, M., & Weiss, N. (1993). Proposal of two new species in the genus Microbacterium: Microbacterium dextranolyticum sp. nov. and Microbacterium aurum sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 43(3). https://doi.org/10.1099/00207713-43-3-549

Zlamala, C., Schumann, P., Kämpfer, P., Valens, M., Rosselló-Mora, R., Lubitz, W., & Busse, H.-J. (2002). Microbacterium aerolatum sp. nov., isolated from the air in the “Virgilkapelle” in Vienna. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52(4). https://doi.org/10.1099/00207713-52-4-1229

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