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A highly sensitive quantification method for 12 plant toxins in human serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry with a quick solid-phase extraction technique

谷口, 賢 名古屋大学

2021.07.16

概要

【緒言】
　有毒植物による食中毒は、主に有毒植物を山菜と誤認して摂取することにより発生する。厚生労働省の食中毒統計によるとその件数は 2010～ 2019 年の過去 10 年間で190 件(患者数 793 人、死者数 14 人)である。有毒植物の食中毒事故が生じた場合、食中毒患者の適切な治療法を選択するために、迅速な毒性成分の特定が不可欠となる。そこで本研究では、我が国において食中毒事例の多い有毒植物(スイセン類、バイケ イソウ類、ジャガイモ)に含まれる主要毒性成分を対象とし、ヒト血清中から迅速に毒性成分を検出し、血清中濃度の測定が可能な手法を開発した。

【対象および方法】
　スイセン類、バイケイソウ類、ジャガイモに含有される主要毒性成分 12 種(Lycorine, Galanthamine, Protoveratrine A, Protoveratrine B, Veratramine, Veratridine, Jervine,Cyclopamine, Cevadine, α-Solanine, α-Chaconine, Solanidine)を対象とした。 １）液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）の条件LC-MS/MS は、島津製作所製 Nexera XR 液体クロマトグラフおよび Sciex 製 QTRAP 4500 質量分析計を用いた。分離カラムとして、CAPCELL PAK ADME(2.1×150 mm、3 µm)を用いた。イオン化法はエレクトロスプレーイオン化法(positive mode)とし、対象成分の標準品を用いて、各成分の MS パラメータを最適化した。

２）抽出法の検討
　市販ヒト血清を用いて、除タンパク法と固相抽出法(SPE 法)を検討した。除タンパク法では、ヒト血清 50 µL に対し 4 倍量の有機溶媒を加え、遠心分離後に上清を蒸発乾固し、メタノールで再溶解したものを測定に用いた。一方、SPE 法では迅速な抽出操作が可能な固相抽出キット(MonoSpin®C18) を用いた。 ヒト血清 50 µL を MonoSpin®C18 に滴下し、溶出液を蒸発乾固後、メタノールで再溶解したものを測定に用いた。

３）分析法バリデーション（定量性の検証）
　分析法バリデーションは、平成 25 年 7 月 11 日 薬食審査発 0711 第 1 号 厚生労働省医薬食品局審査管理課長通知：「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに関するガイドライン」に基づき評価した。

４）実用性の評価
　次の 2 つのモデル試料を用いて実用性を評価した。モデル試料①：ジャガイモ毒性成分が含有されている市販血清を使用した。モデル試料②：Protoveratrine A を 25 µg/kgで 8 週齢の ICR 雄性マウス(n=4)に腹腔内投与し，イソフルラン麻酔後、解剖を行って血清を採取した。このマウス血清を対象薬物が含まれないヒト血清で 50 倍希釈し、ヒト血清模擬試料を作製した。

【結果および考察】
１）LC-MS/MS 条件
　一般的に用いられる分離カラム(ODS カラム) を用いた場合、Lycorine および Galanthamine の分離が不十分なため、両者の疑似ピークが確認された。これらの疑似ピークが定量性に影響することが懸念されたため、別の分離性能を有する CAPCELL PAK ADME を使用した結果、両者を十分に分離することができ、疑似ピークも観察されなかった。質量分析計のパラメータは、各毒性成分の検出強度が最大となるように最適化した。

２）抽出法の検討
　除タンパク法では、アセトニトリル、メタノール、2-プロパノールの有機溶媒を用いた。何れの溶媒においても、バイケイソウ類の毒性成分である Protoveratrine A および B の回収率が 5－69％と低値を示した。この原因を追究した結果、Protoveratrine Aおよび B は、蒸発乾固中にエステル結合が加水分解されることが示唆された。この加水分解は酸性条件で抑制されることから、0.1%ギ酸を添加して酸性条件で蒸発乾固を行ったところ、高い回収率(84 および 90%)が得られた。また、酸性条件下であっても、他の毒性成分も 82－94%の回収率が得られた。同様に、固相抽出法においても、0.1%ギ酸を用いたメタノールを使用した結果、何れの毒性成分についても 82－94%と高い回収率が得られた。2 つの手法は、何れも良好な回収率が得られたが、最終試料の精製効果は固相抽出法が優れていたことから、固相抽出法を用いることとした。

３）分析法バリデーション
　作成した検量線は何れの成分においても r2 が 0.99 以上を示し、良好な直線性が得られた。全成分の検出限界および定量限界は 0.0071–0.15 ng/mL、0.022–0.46 ng/mL となり、高い検出感度を有することが示された。さらに本分析法の定量性を Quality Control 試料で評価した結果、日内・日間の正確性を示す確度は 92-116%、ばらつきを示す精度は 14%以内であったことから、良好な定量性を持つことが示された。本結果は、厚生労働省が示すガイドラインの基準を満たしており、本分析法は信頼性の高い定量法であることが示された。

４）実用性の評価
　モデル試料①の結果：ジャガイモの毒性成分を含有する市販ヒト血清を分析した結果、ジャガイモの毒性成分である α-Chaconine を検出した。その濃度を計測した結果、 0.84±0.02 ng/mL であった。本測定値は、既報で示されている中毒域濃度よりも低いことから、日常食に由来するものと考えられた。
　モデル試料②の結果：模擬血清(n=4)を本法で分析した結果、何れの検体からも Protoveratrine A を検出し、模擬血清中の濃度は 0.11~0.19 ng/mL であった。このような極低濃度の試料であっても、問題なく計測出来ることを実証した。

【結語】
　本研究では、食中毒事故の多い有毒植物の主要成分をヒト血清中から迅速かつ同時に計測できる手法を確立した。本法は、衛生研究所などの食中毒の原因調査に携わる公的検査機関や、食中毒の治療にあたる臨床分野等で活用できるため、社会の安全・安心に大いに貢献するものと考えられる。

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参考文献

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