論文の公開元へCore2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferases accelerate the escape of choriocarcinoma from natural killer cell immunity
概要
【緒言】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)は絨毛細胞より産生される糖蛋白であり、様々な機能を担っている。妊娠においては子宮内血管新生の促進や母体免疫寛容、合胞体性栄養膜細胞への分化などであり、絨毛性疾患においては腫瘍細胞の増殖や浸潤に関与している。絨毛癌では高分岐型糖鎖を持つhyperglycosylatedhCG(H-hCG)が産生され、セリン結合型(O型)H-hCGは絨毛癌の活動性の指標となることや絨毛細胞の浸潤に関与することが報告されている。O型H-hCGはコア2ベータ1,6-Nアセチルグルコサミン転移酵素(C2GnT)により合成されるが、このC2GnT発現は様々な癌種において、宿主による腫瘍排除反応を抑制することで、高い転移能を有し、悪性度と相関するとされてきた。宿主による腫瘍排除反応はT細胞とNK細胞が担っているが、T細胞による腫瘍細胞障害にはHLA発現が必須である。絨毛癌においてHLAは発現していないため、腫瘍排除反応はナチュラルキラー(NK)細胞が主であると思われる。NK細胞の腫瘍細胞傷害経路は、腫瘍細胞表面に発現しているMHCクラスⅠ分子であるMICA/BとNK細胞レセプターであるNKG2Dが結合、認識することでperforin、granzymeBなどの細胞傷害性顆粒を分泌する経路と、腫瘍細胞膜表面のDeathReceptor(DR)にNK細胞リガンドであるtumornecrosisfactorrelatedapoptosis(TRAIL)が結合することで直接腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する2経路がある。今回我々はC2GnTを介した絨毛癌細胞における免疫逃避機構につき、NK細胞の主要免疫機構NKG2D-MICA及びTRAIL-DRの2経路につき検討した。
【方法】
絨毛癌細胞株(Jar、BeWo、JEG3)およびインフォームドコンセントを得て採取した絨毛性疾患組織におけるC2GnTの発現を免疫染色およびウェスタンブロットにて確認した。
ヒト末梢血よりNK細胞を単離、さらにBALB/Cヌードマウス大腿骨および脾臓よりNK細胞を単離した。単離したNK細胞にIL-2を添加し5日間培養後、絨毛癌細胞株と様々なeffector/targetratio(20:1、10:1、4:1)にて共培養し、溶解した細胞より放出されるLDHを測定した。絨毛癌細胞株にTRAILを添加し、24時間共培養後、MTSassayにてcellviabilityを評価した。
C2GnT発現を制御しているGCNT1遺伝子をCRISPR/Cas9systemを利用し、C2GnTknockout絨毛癌細胞株JarKO、BeWoKOを樹立した。O-glycan上のPoly-N-acetyllactosamine鎖を認識するBiotin-conjugateLycopersiconesculentumlectin(LEL)を用いて、レクチンブロットを施行した。またC2GnTcontrolおよびKO細胞とNK細胞を共培養し、細胞傷害性を検討した。NKG2D-MICA経路におけるC2GnTの機能を評価するために、フローサイトメトリーにて絨毛癌細胞株と共培養したNK細胞の脱顆粒を評価した。
C2GnTをKOすることが、MICAの発現および、MICAの糖鎖修飾に影響を与えるか検討するために、MICA抗体を用いて免疫沈降およびウェスタンブロットを施行した。
C2GnT発現の有無が、TRAIL抵抗性に影響するかを検討するために、controlおよびKO細胞にTRAILを添加し、24時間共培養後、MTSassayにてcellviabilityを評価した。またTRAIL経路におけるgalectin-3の働きを検討するために、endo-β-galactosidaseを添加し、共培養した。
C2GnT発現の有無により、MUC1およびDR発現が変化するかをウェスタンブロットにて確認した。またMUC1の糖鎖修飾を検討するために、MUC1抗体を用いて免疫沈降を施行した。
ヒト絨毛癌細胞株JarcontrolおよびKO細胞が、マウスNK細胞により障害されうるかを、マウスNK細胞とヒト絨毛癌細胞株を共培養し検討した。5週齢のBALB/Cヌードマウスに、5×105個のJarcontrolおよびKO細胞を皮下注し、全生存率および腫瘍径を測定した。
【結果】
免疫組織化学染色において、絨毛癌組織およびPSTTではC2GnT強発現、胞状奇胎、正常胎盤組織では弱発現であった(Fig.1A-F)。ウェスタンブロットでも同様の結果であった(Fig.1G)。絨毛癌細胞株においてはJar、BeWoはC2GnT強発現、JEG3は弱発現、HTR-8/SVneoでは発現を認めなかった(Fig.1G)。
C2GnT強発現であるJarおよびBeWoは、C2GnT弱発現であるJEG3に比較し、NK細胞傷害性が低かった(Fig.1H)。またTRAIL添加による細胞傷害性試験でも、同様の結果であった(Fig.1I)。
レクチンブロットにおいて、C2GnTKO細胞ではO-glycan上のPoly-N-acetyllactosamine鎖が減少していた。またC2GnTKO細胞ではNK細胞による細胞傷害性が高かった(Fig.2A)。endo-β-galactosidaseを添加し、galectin-3を除去すると、NK細胞傷害性が改善し、NK細胞の脱顆粒マーカーであるCD107aも増加した(Fig.2B)。
LELを用いた免疫沈降を施行すると、JarKOおよびBeWoKOのMICAに付加しているPoly-N-acetyllactosamine鎖はcontrolに比較し減少していたが、MICAの発現はC2GnT発現の強弱によらなかった(Fig.2C)。
TRAIL存在下によるcellviabilityはC2GnTの発現により増加するが、endo-βgalactosidase添加により、MUC1上のgalectin-3を除去しても、cellviabilityは変化しなかった(Fig.3A)。
MUC1およびDR4の発現はC2GnT発現の有無により変化しなかった。LELを用いて免疫沈降すると、MUC1に付加するPoly-N-acetyllactosamine鎖はKO細胞で有意に減少していた(Fig.3B)。
ヒト絨毛癌細胞株Jarcontrolに比較し、KO細胞ではより高率にマウスNK細胞により傷害された(Fig.4A)。Invivoにおいては、C2GnTKO群はcontrol群に比較し、増殖率が低く(Fig.4B)、全生存率も有意に延長した(p=0.0102,Fig.4C)。
【考察】
本研究は絨毛癌細胞におけるC2GnTの発現と、NK細胞に対する免疫機構を分析した初の研究である。絨毛癌やPSTTにおいてはC2GnTが強発現しており、一方正常胎盤やEVT、胞状奇胎では弱発現であった(Fig.1)。またC2GnTの発現が高い絨毛癌細胞においては、NK細胞傷害性が低く、invivoにおいても同様の結果が示された。
絨毛癌においては、C2GnTによりMICA上にPoly-N-acetyllactosamine鎖が付加されることで、NK細胞の細胞傷害性を低下させた。またendo-β-galactosidase添加によりC2GnTKO細胞を処理しても、NK細胞の機能には変化なく、これはC2GnTKO細胞がPoly-N-acetyllactosamine鎖を持たないためと思われた。NK細胞の細胞傷害性経路の一つは受容体と腫瘍リガンドによる会合であり、NK細胞活性化受容体のうちで、NKG2Dが癌細胞排除において重要な役割を担っている。癌細胞に発現しているMICAはNKG2Dと会合することで、NK細胞が活性化し、perforinやgranzymeBといった細胞傷害性顆粒を分泌し、癌細胞を傷害する。本研究において、O-glycanにgalectin-3が結合したPoly-N-acetyllactosamine鎖が、C2GnTによりNKG2D会合部であるMICA糖鎖付加されることで、NKG2D-MICAの会合力を減弱させ、その結果NK細胞の絨毛癌に対する細胞障害性が低下した。
絨毛癌において、C2GnTはTRAILを介したNK細胞障害経路にも関与している。癌細胞表面のMCU1は、Poly-N-acetyllactosamine鎖が付加されたcore2O-glycanが多数糖鎖修飾されている。NK細胞上のTRAILが、DR4などのdeathreceptorに結合することで細胞死を誘導するが、MUC1上のPoly-N-acetyllactosamine鎖が腫瘍細胞表面のDR4とNK細胞上のTRAILとの結合を阻害する。本研究では、galectin-3とMUC1の関連は、TRAILの存在下で絨毛癌細胞の生存率に影響を与えなかったことから、polyN-acetyllactosamine鎖が絨毛癌細胞へのTRAIL-DR4結合の分子シールドとして機能する可能性がある。
【結語】
本研究は、絨毛癌細胞において、C2GnTがMICAおよびMUC1の糖鎖修飾を介して、NKG2D-MICAおよびTRAIL-DR免疫抑制経路に関与している可能性があることを示唆している。C2GnT活性を低下させる特定の阻害剤により、絨毛癌のNK細胞に対する感受性を回復させ、腫瘍排除機能を促進し、転移を抑制する可能性がある。
