論文の公開元へ腎癌の進展におけるELOVL5による脂肪酸伸長の生物学的意義に関する研究
概要
筑 波 大 学
博士（医学）学位論文
腎癌の進展における ELOVL5 による脂肪酸伸長の
生物学的意義に関する研究
2022
筑波大学大学院博士課程人間総合科学研究科
新田
聡
この学位論文は、ELOVL5-mediated fatty acid elongation promotes cellular
proliferation and invasion in renal cell carcinoma (Satoshi Nitta, Shuya Kandori, Ken
Tanaka, Shotaro Sakka, Masanobu Siga, Yoshiyuki Nagumo, Hiromitsu Negoro,
Takahiro Kojima, Bryan J. Mathis, Toru Shimazui, Takafumi Miyamoto, Takashi
Matsuzaka, Hitoshi Shimano, and Hiroyuki Nishiyama. Cancer Science, 2022, Aug;
113(8):2738-2752. doi: 10. 1111/cas.15454)の内容を Wiley 社の規定に従って再利
用している。【原典論文】
内容
1
背景............................................................................................................................ 1
1.1
腎癌の現状と課題 ......................................................................................... 1
1.2
生体内における脂質と脂肪酸の機能 .............................................................. 2
1.3
がんにおける脂質代謝と ELOVLs の役割...................................................... 4
2
目的............................................................................................................................ 7
3
方法............................................................................................................................ 8
3.1
患者背景と使用検体 ...................................................................................... 8
3.2
免疫組織化学染色 ......................................................................................... 8
3.3
細胞と細胞培養 ............................................................................................. 9
3.4
細胞増殖アッセイ ....................................................................................... 10
3.5
細胞浸潤アッセイ ....................................................................................... 10
3.6
脂肪酸の調整 .............................................................................................. 11
3.7
ウエスタンブロット解析 ............................................................................. 11
3.8
CRISPR/Cas9 システムによる ELOVL5 ノックアウト株の作成 .................. 13
3.9
ヌードマウス異種移植 ................................................................................ 14
3.10 RNA シークエンス解析における遺伝子発現の評価 ...................................... 14
3.11 RNA の抽出と quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction
(qRT-PCR) .......................................................................................................... 15
3.12 siRNA による CCL2 遺伝子発現抑制 ........................................................... 16
3.13 培養上清における CCL2 タンパクの検出 .................................................... 17
3.14 アポトーシスの評価 .................................................................................... 17
3.15 脂肪滴の染色 .............................................................................................. 17
3.16 RNA シークエンス ...................................................................................... 18
3.17 RNA シークエンス解析 ............................................................................... 18
3.18 脂肪酸解析 .................................................................................................. 19
3.19 統計解析 ..................................................................................................... 20
4
結果.......................................................................................................................... 22
4.1
腎癌患者における ELOVL5 の発現と予後との関連 ..................................... 22
4.2
ヒト腎癌細胞の増殖・浸潤における ELOVL5 の役割 .................................. 23
4.3
ELOVL5 による脂肪酸伸長とヒト腎癌細胞の増殖・浸潤との関連 .............. 24
4.4
ELOVL5 を介したヒト腎癌細胞の増殖の機序 ............................................. 25
4.5
ELOVL5 を介したヒト腎癌細胞の浸潤の機序 ............................................. 28
5
考察.......................................................................................................................... 32
6
結語.......................................................................................................................... 39
7
要約図 ...................................................................................................................... 40
8
参考文献 .................................................................................................................. 41
9
謝辞.......................................................................................................................... 51
10
略語 ...................................................................................................................... 52
11
図表 ...................................................................................................................... 56
1 背景
1.1 腎癌の現状と課題
腎癌は、成人における悪性腫瘍の 2－3％を占め、
増加傾向にある 1,2。
欧米諸国では 2020 年に人口 10 万人あたり、
19.3 人が腎癌と診断され、
6.3 人が死亡している 3。欧米諸国と同様、本邦でも近年増加傾向にあ
り、2020 年には人口 10 万人あたり、19.9 人が腎癌と診断され、6.8 人
が死亡している 3。腎癌のリスク因子として肥満や高血圧、喫煙などが
知られており、特に肥満はその相対リスクが高いことが報告されてい
る 4。
腎癌の組織型として、淡明型腎細胞癌の頻度が最も高く（約 75％）、
次いで乳頭状腎細胞癌（約 15％）、嫌色素性腎細胞癌（約 5％）と続く
1
。淡明型腎細胞癌は近位尿細管上皮細胞を発生母地とし、細胞内は脂
質およびグリコーゲンに富み、組織学的に淡明な細胞質を有すること
が特徴であるが、その豊富な脂質の役割については明らかにされてい
ない。
腎癌に対する治療法として、限局性の腎癌（Ⅰ－Ⅲ期）の症例に対し
ては、腎部分切除術や根治的腎摘除術といった手術療法が施行され、5
年全生存率 70－90％の良好な予後が期待される 2。一方、約 3 分の 1 の
1
症例は診断時に転移を有し（Ⅳ期）、また手術療法を施行された 20－
50％の症例は後に遠隔転移を生じる 2。根治切除不能または転移性の腎
癌の症例に対してはチロシンキナーゼ阻害剤や mammalian target of
rapamycin (mTOR) 阻害剤といった分子標的治療薬、免疫チェックポイ
ント阻害薬などの薬物療法を主体とした治療が施行される。近年、免
疫チェックポイント阻害薬を中心とした腎癌に対する薬物併用療法が
進歩しており、従来の分子標的治療薬と比べて、奏効率や全生存期間
の飛躍的な向上を示している一方で、依然として根治に至る症例は非
常に稀である
5,6
。そのため、これまでの分子標的治療や抗腫瘍免疫の
活性化といった従来の機序とは異なる新たな治療法の開発が求められ
ている。
1.2
生体内における脂質と脂肪酸の機能
脂質は生体内でエネルギー源、生体膜成分、シグナル伝達分子とし
ての生物学的機能をもつ
7,8
。中性脂質は細胞内で脂肪滴として貯蔵さ
れ、必要に応じて分解されてエネルギーを産生する 9。リン脂質やスフ
ィンゴ脂質は生体膜における二重構造を構成し、生体膜の流動性、受
容体や膜チャネルの機能に影響を及ぼすほか、protein kinase B (AKT)経
2
路などのシグナル伝達に関与する 8,10。また、プロスタグランジンやロ
イコトリエンなどの脂質メディエーターに合成され、シグナル分子と
して機能する 11。
脂肪酸は脂質の基本骨格であり、多彩な生理機能を有する。脂肪酸
は炭化水素基とカルボキシル基で構成されており、炭化水素基の二重
結合の有無によって、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸に分類される 7。不飽
和脂肪酸は二重結合の数や位置によって一価不飽和脂肪酸と多価不飽
和脂肪酸に分類される 7。また、炭化水素基の炭素鎖の長さによって、
短鎖脂肪酸（2－4 個）、中鎖脂肪酸（6－10 個）、長鎖脂肪酸（12 個以
上）に分類されるが、哺乳類の組織では長鎖脂肪酸が大部分を占める
12
。生体内で合成された、あるいは食事由来の脂肪酸は、小胞体膜上に
存在する酵素によって不飽和化や炭素鎖の伸長といった反応を受ける
7
。不飽和化に関与する酵素には stearoyl-coA desaturases (SCDs)と fatty
acid desaturases (FADS)、炭素鎖の伸長に関与する酵素には elongation of
very-long-chain fatty acids (ELOVLs)がある 7。脂質の基本骨格となる脂
肪酸の不飽和度や炭素鎖長の違いが脂質の機能的多様性に影響する。
長鎖脂肪酸は縮合、還元、脱水、還元の四段階の反応を受けて合成さ
れる。ELOVLs はその中で縮合反応を触媒する酵素であり、哺乳類で
3
は 7 種類のアイソフォーム（ELOVL1－7）が報告されている 7。また、
ELOVLs のアイソフォームによって基質とする脂肪酸や発現組織が異
なっている。ELOVL1、ELOVL3、ELOVL6、ELOVL7 は飽和脂肪酸あ
るいは一価不飽和脂肪酸を基質とし、ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 は
多価不飽和脂肪酸を基質としている 7 。また、ELOVL1、ELOVL5、
ELOVL6 の遺伝子発現は組織普遍性が高い一方、ELOVL2、ELOVL3、
ELOVL4、ELOVL7 は組織特異性が高く、ELOVL2 は肝臓と精巣、
ELOVL3 は褐色脂肪組織、ELOVL4 は網膜や脳、皮膚、精巣、ELOVL7
は腎臓や膵臓、副腎、前立腺で多く発現している 7。
1.3 がんにおける脂質代謝と ELOVLs の役割
がん細胞では過酷ながん微小環境下での細胞増殖や生存のため、脂
質代謝を含めた細胞内代謝を変化させている。CD36 や fatty acid-binding
protein (FABP)、fatty acid transport protein (FATP)を介した細胞外からの
脂肪酸の取り込みや、グルコース代謝やグルタミン代謝を介した細胞
内での脂肪酸合成が亢進しており、脂肪酸を β 酸化によるエネルギー
産生に利用しているほか、脂肪滴として貯蔵しており、腎癌細胞をは
じめとするさまざまながん細胞で脂肪滴の形成が亢進している
4
13,14
。
また、脂肪酸合成に関わる転写因子 sterol regulatory element-binding
proteins (SREBPs) や、その下流の分子である acetyl-CoA carboxylase
(ACC)や fatty acid synthase (FASN)などの発現が亢進している 13,14。
上述のようにがん細胞では脂肪酸の合成が亢進し、がん細胞の生存
に寄与することが証明されている。一方、脂肪酸の組成の違いががん
細胞へ与える影響について、脂肪酸の不飽和化の点では、腎癌を含む
さまざまな癌種において SCD1 によってがん細胞の増殖・浸潤が促進
されることが報告されている 15-17。脂肪酸の伸長の点では、癌種によっ
て ELOVLs の異なる役割が報告されている。乳癌では ELOVL1 はがん
細胞の増殖を促進するが、ELOVL2 はがん細胞の遊走とコロニー形成
を抑制する 18,19。前立腺癌では ELOVL5 や ELOVL7 はがん細胞の増殖
や生存を促進するが、ELOVL2 はがん細胞の増殖や遊走、浸潤を抑制
する
20-23
。神経膠腫では ELOVL2 は epidermal growth factor receptor
(EGFR)シグナルを介して幹細胞の増殖や生存を促進する
ELOVL6 はがん細胞のコロニー形成を促進する
24
。肺癌では
25
。したがって、癌種
によって ELOVLs、さらに長鎖脂肪酸の役割が異なると考えられる。
ELOVL5 は食事由来のω6 脂肪酸（メチル基から 6 番目の炭素に最
初の二重結合を有する）であるリノール酸およびω3 脂肪酸（メチル基
5
から 3 番目の炭素に最初の二重結合を有する）であるリノレン酸を基
質として、それぞれアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸への伸
長に関与する酵素である（図 1）7。ELOVL2 はエイコサペンタエン酸
を基質として、ドコサヘキサエン酸への伸長に関与する酵素である（図
1）7。腎癌では ELOVL5 と ELOVL2 の発現が亢進し、多価不飽和脂肪
酸が豊富に含まれていることが報告されているが、その生物学的意義
については解明されていない
26
。我々のグループでは、先行研究にお
いてヒト腎癌細胞における ELOVL2 の役割について報告した 27。この
研究では、ELOVL2 がヒト腎癌細胞における腫瘍増殖を促進し、予後
不良と関連することを示した。一方で、ヒト腎癌細胞における ELOVL5
の役割については解明されていない。
先述したように、脂質の主成分である脂肪酸は炭素鎖長や不飽和度
の違いによりその組成が変化し、脂質の生理活性に影響を及ぼす。
ELOVL5 を介した脂肪酸の組成変化がヒト腎癌の進展に重要な役割を
果たしているという仮説のもとで研究を進め、ヒト腎癌における
ELOVL5 の生物学的意義を明らかにすることを目的とした。
6
2 目的
本研究では、腎癌の進展メカニズムにおける ELOVL5 の生物学的意義
を明らかにすることを目的とする。
7
3 方法
3.1
患者背景と使用検体
筑波大学附属病院臨床研究倫理審査委員会の承認の下で行った（承
認番号 H28-104）。2006 年から 2021 年までに腎癌と診断され、筑波大
学附属病院にて根治的腎摘除術または腎部分切除術を施行された 70
例（淡明型腎細胞癌 40 例、乳頭状腎細胞癌 20 例、嫌色素性腎細胞癌
10 例）を対象とした。全対象患者から書面による同意を得た。
全 70 例の原発巣におけるホルマリン固定パラフィン包理（formalinfixed paraffin-embedded ; FFPE）を使用した。がんの進展度は国際対が
ん連合（Union for International Cancer Control ; UICC）の TNM 臨床病
期分類に基づいて評価した
28
。淡明型腎細胞癌の病理学的悪性度は
Fuhrman 分類に基づいて評価した 29。
3.2
免疫組織化学染色
免疫組織化学染色は過去の報告に従って実施した 30。使用した一次
抗体とその希釈濃度は下記の通りである。HIstofine Simple Stain MAX
PO® （Nichirei Bioscience 社）を二次抗体として使用し、ジアミノベン
ジジンにより発色した。
8
腎癌患者における ELOVL5 と CCL2 のタンパク発現を評価するた
め、癌部と非癌部における ELOVL5 と CCL2 の染色強度を比較し、癌
部の方が強く染色された場合を高発現症例とし、それ以外を低発現症
例と定義した。Ki-67 スコアリングは光学顕微鏡下倍率 400 倍で観察
し、無作為に選んだ 10 視野について全細胞数あたりの陽性核の割合
を算出し、その平均値を Ki-67 スコアとした。
3.3
提供元
商品コード
希釈濃度
anti-ELOVL5
Sigma-Aldrich
HPA047752
1:2500
anti-Ki67
Dako
M7240
1:200
anti-CCL2
Proteintech
25542-1-AP
1:200
細胞と細胞培養
ACHN と 786-O （ ヒ ト 腎 癌 ） 細 胞 株 は American Type Culture
Collection より購入し、OS-RC-2（ヒト腎癌）細胞株は理化学研究所バ
イオリソースセンターより購入した。SKRC52（ヒト腎癌）細胞株は
Ludwig Institute for Cancer Research の LG Old 博士より分与していただ
いた。RPTEC（ヒト近位尿細管上皮細胞）細胞株は Colnetics より購入
した。これらの細胞株は 10％ ウシ胎児血清（fetal bovine serum : FBS）
9
を添加した RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培地を使用し、37℃、
CO2 濃度 5％の条件下で培養した。ELOVL5 ノックアウト株の培養は、
G418 硫酸塩を添加した RPMI 培地で行った。
3.4
細胞増殖アッセイ
Cell Counting Kit-8（Dojindo 社）を使用して生細胞数を計測した。96
ウェルマイクロプレートの各ウェルへ細胞懸濁液（細胞濃度 1×104
cells/ml）を 100 µL ずつ入れて一定時間培養後に、Cell Counting Kit-8
溶液を 10 µL ずつ加え、1 時間後にマイクロプレートリーダーで 450
nm の吸光度を測定し、生細胞数を計測した。各細胞において細胞増殖
アッセイは 2 回以上行い、再現性を確認した。 ...
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