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３次元超解像顕微鏡法の開発と生物学への応用

池滝 慶記 北里大学

2022.10.13

概要

顕微鏡分野において、高い深さ分解能が得られないことが歴史的な技術課題として存在する。本研究では、この技術課題に対して３次元超解像顕微鏡法を提案し、それを実証すると共に生物試料への観察評価に応用した。
本顕微鏡法は、ポンプ光で蛍光色素分子を励起し、波長の異なるイレース光を同時照射することで蛍光を人為的に抑制できる蛍光抑制効果に着目したものである。特に、誘導放出により蛍光抑制効果を起こす方式は、STED（Stimulated depletion emission）と呼ばれる。もし、３次元的に光が当たらない微細空間領域を持つようにイレース光を集光し、これをポンプ光と同時に集光すると回折限界より微細な３次元的な蛍光スポットが生成できる。このスポットで蛍光染色した試料を空間走査すると、回折限界を上回る３次元分解能で試料観察ができる。本論文では、波動光学と２波長分光学を基礎に、スカラー電場モデルにより新規に３次元超解像顕微鏡法の基礎結像理論を構築した。そして、より精密なベクトル電場モデルを導入した数値解析を行い、３次元超解像顕微鏡法の結像性能を探索したところ、本顕微鏡法は少なくとも(100nm)3を上回る３次元分解能が得られることが判明した。そして、検証実験を行う為に、構築した結像理論を用いて実用的な顕微鏡照明光学系を設計し、各種蛍光色素分子の蛍光抑制効果に関する分光データを実測した。これらの知見を基に、原理検証用の３次元超解像顕微鏡装置を組み上げ、提案する顕微鏡法の空間分解能を実測した。その結果、理論予測に見合う(100nm)3を上回る３次元分解能が得られることを確認した。本装置を用い、蛍光タンパクが発現した神経細胞をはじめとする生物試料を観察したところ、通常の光学顕微鏡法では観察不可能な微細で複雑な立体構造を空間分解できることが分かった。特に、生物分野でニーズが高い、E-GFPが発現したライブ試料に対しても３次元超解像顕微鏡観察ができることが確認できた。提案する３次元超解像顕微鏡法は構造が単純な位相板を対物レンズと一体で市販のレーザー走査型顕微鏡に取り付けるだけで実施できるので、本顕微鏡法の優れた汎用性と実用性を示すことができた。また、蛍光抑制効果に関して分光学的に精査したところ、STEDの概念とは相反する照明波長領域でも蛍光抑制効果を誘導することが可能であり、より広い照明波長領域で３次元超解像顕微鏡法が適用できることを新たに発見した。本論文では、３次元超解像顕微鏡法において残された解決すべき技術課題に関して論議をしつつ、更なる機能拡大に向けての提言を行った。

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参考文献

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