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耐病性育種に向けたイチゴおよびニラSSRマーカー等の大量開発に関する研究

田﨑 公久 法政大学 DOI:info:doi/10.15002/00022981

2020.06.18

概要

世界における栽培イチゴ(Fragaria×ananassa)の作付面積および生産量は,それぞれ53万ha(2017年),1,295万t(2017年)であり,その需要の高まりから,2000年と比較すると作付面積で1. 4倍,生産量で2. 3倍と増加している. 国内のイチゴの作付面積および収穫量は,それぞれ5,200ha(2018年),16. 2万t(2018年)である. そのうち,栃木県のイチゴ生産は,作付面積545ha(2018年),収穫量24,900t(2018年)である. 作付面積は18年間,収穫量は51年間連続日本一であり,「イチゴ王国」呼称されている.
 ニラ(Allium. tuberosum)は,主にアジア地域にて栽培され,国内の作付面積および生産量は,それぞれ2,020ha(2018年),5. 6万t(2018年)である. 栃木県のニラ生産は,作付面積が360ha(2018年)であり全国一位,収穫量10,600t(2018年)であり全国二位である.
栃木県農業試験場におけるイチゴ,ニラの品種育成能力の評価は極めて高く,‘女峰’(1985年品種登録),‘とちおとめ’(1996年),‘栃木i27号’(商標登録名:スカイベリー,2014年)等を育成し,近年では‘栃木i37号’を登録出願(2018年)している. ニラにおいては,‘きぬみどり’(1995年),‘ゆめみどり’(2017年)を育成している.

 第1章では栃木県育成イチゴ品種の育成者権保護を目的とした品種識別技術の開発について論じられている. イチゴにおけるRAPD-STSマーカーおよびマルチプレックスPCRによる品種識別技術は,‘とちおとめ’および‘とちひめ’を対象として,特異的品種識別マーカーの開発が行われている. まず,RAPDおよびAFLPマーカーによるスクリーニング後,再現性を高めるためSTS化が行われ,その後,複数マーカーを同時に検出できるようマルチプレックスPCR化が行われている.
 RAPD法により467種類のランダムプライマー,AFLP法により256種類のプライマー組合せによりスクリーニングした結果,RAPD法で4マーカー,AFLP法で6マーカーを選抜している. RAPD4マーカーおよびAFLP1マーカーについてはSTS化を行い,3種類のSTS化プライマーをセット化(プライマーセット1:E89-STS,EcoRI-ACA/MseI-CGG-STSおよびE24-STS)している. 本研究成果である日本初の本プライマーセット開発により,イチゴ25品種・系統間で両品種との差異を1回のPCRにより識別可能としている.

 第2章ではイチゴにおけるSSRマーカーの大量開発について論じられている. イチゴのSSRマーカーについては,DNAの反復配列部分を濃縮し,SSRマーカーを効率的に作製できる濃縮ライブラリー法を用いたGenomic-SSRマーカーと本県で蓄積した5,494 Expressed sequence tag(EST)由来のEST-SSRマーカーを大量開発している. SSR濃縮ライブラリーは,CA反復配列とGA反復配列を濃縮し,PCRによりスクリーニングした結果,3,913クローンにおいてSSR配列が含まれていると推定している. シーケンスした907クローンの結果は,868クローン(95. 7%)でSSR配列が検出され,プライマー設計可能な配列が456クローン(50. 3%)を得ている.
 イチゴEST-SSRマーカーについては,723EST(13. 2%)からSSR配列が検出されている. そのうち,プライマー設計可能なESTは544EST(9. 9%)であった. それらの結果から,Genomic-SSRマーカーおよびEST-SSRマーカーの合計で1,000マーカーが作製されている.

 第3章ではイチゴ炭疽病に対する耐病性連鎖マーカーの検索のため,‘とちおとめ’בいちご中間母本農2号’F1集団のマーカー分離比の検討について論じられている.
 SSRマーカーによる‘とちおとめ’および‘いちご中間母本農2号’間の多型検索は,Genomic-SSRで126プライマー(76. 4%),EST-SSRマーカーで17プライマー(28. 3%)で多型が得られている. ‘とちおとめ’בいちご中間母本農2号’F194個体におけるSSR多型分離比は,‘とちおとめ’では1:1および1:0の分離比を示すアリルが119アリル(90. 8%)‘いちご中間母本農2号’では131アリル(84. 1%)と大多数を占めている. また,14プライマーが複2倍体的な共優性的な関係を示すアリル分離であることを明らかにしている. この結果は,栽培イチゴ(8倍体)が2倍体的挙動を示していることを明らかにしている.

 第4章ではニラにおけるNGSを活用したSSRマーカーの大量開発の検討について論じている. ニラにおけるSSRマーカー開発は,SSR濃縮ライブラリーとともにNGSを活用し,遺伝子そのものが座乗できるようにRNA-seqによるSSRマーカー開発を行ている. プライマー設計可能な配列は,RNA-seqで5,026個(mode=mmvp)および1,769個(mode=misa),濃縮ライブラリーで両モードともに1,228個(mode=mmv),ESTで190個(mode=mmvp)および105個(mode=misa)であり,短期間で大量のSSRマーカーを開発している. 多型に関しては,112プライマーを用いて,H12C2(非単為発生・非複相大胞子形成)および97-11-7(非単為発生・複相大胞子形成)間で調査した結果,3’UTR領域で54. 8%,CDS領域で37. 0%,5’UTR領域で30. 0%のプライマーで多型が検出されている. マーカー検索の際は,3’UTR領域の設計プライマーを用いることにより,効率的に多型が検出できることを明らかにしている. また,6塩基モチーフが57. 1%と最も多型検出割合が多かった. 一般的に6塩基モチーフは多型が少ないと考えられており,このことはニラにおける特徴と考えられる. 配列特徴としては,同じネギ属の解析と同様にACモチーフの割合が多く,特に濃縮ライブラリーでは顕著でAGが20. 6%に対し,ACは50. 6%に達した. これは他の報告同様にネギ属の共通の特徴であると考えられる.

 本研究により,イチゴ品種識別技術が開発されて以降,違法な輸入農産物の流通が停止し,抑止力として大きな効果が認められている. また,新たな栃木県育成品種については,開発したSSRマーカーを用いた品種識別技術が開発され,現在,育成者権保護に活用されている. さらに,イチゴ育種においては,SSRマーカーおよびAFLPマーカーを活用して,イチゴ萎黄病耐病性や四季成り連鎖マーカーの遺伝解析が進められ,イチゴ萎黄病耐病性や四季成り性連鎖マーカーが開発されている. 現在,萎黄病耐病性や四季成り性に関しては,約5,000実生から1/2の2,500実生に減らすことに成功し,育種の効率化につながっている. 一方,ニラにおけるSSRマーカーにおいては,複相大胞子形成連鎖マーカーの開発や品種登録前の交雑率検定マーカーの開発に用いられ,ニラ育種に活用されている. 今後,さらに耐病性連鎖マーカーの開発に本SSRマーカーが活用されることが期待される.

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参考文献

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