論文の公開元へ肺組織在住マクロファージの培養・増殖法の開発と増殖させた肺マクロファージの性状解析
概要
マクロファージ (Mø) は，体内に侵入した病原体など異物の排除を担い，組織・器官の組織構築や形態形成にも関与する多機能な細胞である。Mø は多様な組織・器官に組織在住 Mø として定着し，器官特異的な機能を発揮する。成体において，Mø は 2 種類に分類される。(1) 定常状態で組織・器官に定着し，各器官の恒常性を維持するために器官特異的な機能を発揮する組織在住 Mø と，(2)血液中を循環する骨髄で分化した単球が炎症部位に浸潤して Mø に分化し一時的に定着する動員 Mø の 2 種類である。これまで，成体のすべての組織在住 Møは最終分化を遂げた細胞で自己増殖せず，骨髄由来の単球の浸潤により徐々に置き換わり補充されていると考えられていた。現在では，成体の組織在住 Møの多くは，卵黄嚢の食細胞および胎生期の肝臓でつくられた単球から分化した Mø (胎生 Mø) に由来することが明らかになっている (Wu and Hirschi, 2020; Cox et al., 2021; Nobs and Kopf, 2021)。胎生 Mø は，胎生期にあらゆる組織・器官に浸潤した後，各器官に固有のニッチ (固有の微小環境) に定着し，器官特異的に分化して組織在住 Mø になるとともに，定常状態でもニッチからのシグナルを受容して自己増殖を行い，成体でもポピュレーションが維持されている (Wu and Hirschi, 2020; Cox et al., 2021; Nobs and Kopf, 2021)。一方で，組織在住 Mø の自己増殖性が再検討された結果，腸の間質や真皮など一部の環境では，胎生 Mø は一時的にニッチに定着するものの，これらのニッチでは十分な増殖シグナル因子が分泌されない。従って，腸の間質や真皮などにおける胎生 Mø は，定常状態で局所的な自己増殖をすることができず，生後，骨髄で分化した単球の浸潤により徐々に置き換わっていくことも明らかになっている (Sieweke and Allen, 2013; Chakarov et al., 2019)。以上の報告を基に著者は，胎生 Mø に由来する成体の組織在住 Mø において，各器官に特異的で，十分な増殖シグナル因子を分泌する Møニッチを培養系で再構築できれば，培養増殖させることが可能になると考えた。
最近，Guilliams らは，各器官に存在する組織在住 Mø は器官固有のニッチに依存した自己増殖性を示し，器官特異的に分化すると報告している (Guilliams and Scott, 2017; Guilliams et al., 2020)。また，組織在住 Mø の自己増殖に必要な因子である colony stimulating factor 1 (CSF1)，colony stimulating factor 2 (CSF2) そして interleukin 34 (IL34) がニッチから産生されることが明らかにされている (Guilliams et al., 2013; Sieweke and Allen, 2013; Guilliams et al., 2020)。これらの報告から，特定の器官における胎生 Mø 由来の組織在住 Mø は，その器官に存在するニッチ形成細胞が増殖すれば，増殖することができると考えられる。実際に Ogawa らは，器官固有の間質細胞と混合培養することにより，脳，肝臓，脾臓などの組織在住 Mø を継代培養する方法の開発に成功している (Ogawa et al., 2019)。培養系を用いた Mø の研究では，骨髄に由来する単球から分化させた Møや単球／Mø 細胞株が広く使用されている。組織在住 Mø に関する多くの研究では，単球／Mø マーカー分子を使った免疫染色による肺組織内の分布状態の in vivo 解析や，組織・器官から細胞を分散させた直後の細胞を単球／Mø マーカー分子を使ってセルソーターで分離して解析する，あるいはフローサイトメトリーで単球／Mø マーカー分子を使って分画し解析する ex vivo 解析が行なわれている。しかしながら，これまで，大量の組織在住 Mø を簡便に回収する方法はなく，in vitro での多様な実験に供することは困難であった。従って，組織在住 Møの増殖法が確立できれば，培養系における組織在住 Mø の研究用途の拡大が期待できる。
肺の組織在住Mø は局在性から，肺胞と気道内に局在する肺胞Mø (alveolar Mø: AMø) と肺胞中隔や気管支・細気管支周囲の間質に局在する肺間質 Mø (pulmonary interstitial Mø: pIMø) に分類される。AMø は気管支肺胞洗浄から容易 に回収できるため，in vitro，ex vivo，in vivo のすべての領域で研究が進んでいる。 AMø は，胎生 Mø (胎生期の肝臓で分化した単球) に由来して自己増殖によりポ ピュレーションが維持されている組織在住 Mø で，肺胞上皮細胞がニッチであり，ニッチからのシグナルを受けて AMø としての特性が付与され，サーファクタン トの恒常性，病原体の排除，免疫恒常性に重要な機能を果たすことが知られて いる (Guilliams et al., 2013; Allard et al., 2018; Puttur et al., 2019)。一方，pIMø は分 化途中の AMø あるいは AMø のプールであるという過去の認識から研究は十分 に行われておらず，不明な点が多い組織在住 Mø である (Liegeois et al., 2018; Schyns et al., 2018)。近年，その免疫制御機能に注目が集まっているが (Liegeois et al., 2018; Schyns et al., 2018)，pIMø の培養増殖法や簡便な細胞分離法は確立され ておらず，この点がその性状が十分に解明されていない理由と考えられる。Tan らは，pIMø は卵黄嚢で分化した食細胞に由来する Mø (胎生 Mø) と生後に骨髄 で分化した単球に由来するMø の2 種類の亜集団から構成されると報告している (Tan and Krasnow, 2016)。Schyns らも同様に，気管支周囲の間質に局在し自己増 殖性を示す胎生Mø に由来すると考えられるpIMø と肺胞中隔に存在し自己増殖 性を示さない単球由来のpIMø の2 種類の亜集団から構成されると報告している(Schyns et al., 2019)。一方，pIMø は単球由来で自己増殖性を示さない 3 種類の亜 集団から構成されるとの報告や (Gibbings et al., 2017)，pIMø は単球由来で自己 増殖性を示さない組織在住 Mø で，血管周囲と神経線維周囲に局在する 2 種類の 亜集団から構成されるとの報告も認められる (Chakarov et al., 2019)。このように， pIMø の由来については未だ決着がついておらず，2 種類の亜集団と 3 種類の亜 集団のどちらで構成されるかも分かっていない。
本研究では，Ogawa らが開発した組織在住 Mø の継代培養・分離法 (Ogawa et al., 2019) を改変し，BALB/c マウスと C57BL/6 マウスの肺を材料に pIMø の継代培養・分離法の開発を試みた。胎生 Mø 由来の組織在住 Mø には，定着器官固有のニッチに依存した自己増殖性と分化特性が付与されると考えられている (Guilliams and Scott, 2017; Guilliams et al., 2020)。前述のように，pIMø には胎生 Mø に由来する亜集団の存在が示唆されるため，「pIMø のニッチ形成細胞を増殖させることで，pIMø の増殖が可能になる。」と考えた。この仮説を検証するため，肺動脈経由の灌流により血液細胞を除去することで単球を，気管支肺胞洗浄により AMø を，それぞれできる限り除去し，pIMø を比較的多く含むと考えられる肺を材料に，肺組織在住 Mø の継代培養・分離を試みた。その結果，増殖できた肺組織在住 Mø の単球／Mø マーカー分子の発現性状を解析し，胎生 Møに由来する pIMø の亜集団の発現性状と一致するか検討した。一方，骨髄で増殖・分化した単球を材料に分化させた動員 Mø を用い，M1 型 (炎症型) と M2型 (抗炎症型) Mø に分極化誘導する研究は数多く認められ，M2 型 Mø に分極化誘導した際は BALB/c マウスの動員 Mø の方が，M1 型 Mø に分極化誘導した際は C57BL/6 マウスの動員 Mø の方が分極誘導し易いと報告されている (Mills et al., 2000; Mills, 2015)。そこで，増殖させた，BALB/c マウスと C57BL/6 マウスの肺組織在住 Mø を材料に，動員 Mø のみでなく組織在住 Mø にもこの分極化性状が認められるか，増殖させた組織在住 Mø の性状解析の一環として検討した。
この論文で使われている画像
