Light-intensity dependent photoreaction and enzyme activity of BlrP1

概要

BLUFタンパク質は主にバクテリアから発見される青色光センサータンパク質であり、バクテリアの生活様式の変化を光依存的に切り替えていると考えられている。これまでの研究によって、BLUFドメイン内の発色団であるFAD近傍において光励起後に起こる構造変化は詳細に調べられている一方で、発色団から離れた部位まで伝搬される構造変化について調べた研究はほとんどなかった。本研究ではBLUFドメインとEALドメインから構成されるBlrP1を用いて、BLUFドメインからEALドメインへと構造変化が伝達する過程を時間分解で検出することを目指した。BlrP1は青色光依存的にバクテリアのセカンドメッセンジャーであるc-di-GMPを加水分解する酵素であり、活性が光照射下で増大することからBLUFドメインからEALドメインへと構造変化が伝搬していると考えられる。構造変化の検出には拡散係数を時間分解で測定可能な過渡回折格子法(TG法)を用いた。さらに、検出される構造変化が活性の上昇と確かに関連することを活性測定から明らかにした。

　TG測定の結果、BlrP1のBLUFドメインの中では拡散係数に反映されるような構造変化が光励起前後で起こらないことが明らかになった。全長のBlrP1においては光励起後に拡散係数が減少する様子が捕らえられたため、BLUFドメイン内の小さな構造変化が全長における構造変化を誘起していることが分かった。TG信号の濃度依存性の測定からは、タンパク質濃度が高いほど構造変化を起こす分子の割合も増えることが分かった。排除体積クロマトグラフィーやダイマー化を阻害する変異体の測定によって、この濃度依存性はダイマーとモノマーの平衡で説明されることが分かった。つまり、ダイマーを励起すると構造が変化し、モノマーでは起こらない。また、TG信号の励起パルス光強度依存性を調べることで、ダイマーの内に含まれる2つのBLUFドメインの両方が励起された際に生じるLLダイマーにおいて構造が変化していることが分かり、その変化量と変化の速度定数を決定することができた。さらに、この構造変化では二次構造や会合状態は変化せずドメイン間の配向変化などを含む三次構造・四次構造が変わることが分かった。

　また、TG法によって検出した構造変化と酵素活性の相関を調べた。酵素1分子当たりの活性を表すkcatはタンパク質濃度にシグモイド状に依存していた。この結果からはモノマーの光誘起活性上昇は小さい一方でダイマーの活性上昇は大きいことが分かり、構造変化を起こすダイマーが活性上昇に重要であることが示された。酵素活性測定と同時に吸収スペクトルを測定して、光照射下での励起された分子の数を観測することで、励起された分子がどの様に活性に影響を与えるか調べた。その結果、酵素活性は励起分子の濃度の二乗に比例しており、この結果はLLダイマーにおいて活性上昇が起きていることを意味しており、TG法で観測された構造変化が活性に寄与していることを支持している。

　本研究によって、BlrP1のダイマーに特異的な構造変化を検出した。この構造変化はダイマーに含まれる両方のBLUFドメインを励起した時にだけ起こり、さらに酵素活性の上昇と相関があった。このように明らかになった分子の反応から、BlrP1が強い青色光に特異的に応答するための光強度センサーである可能性を提唱した。