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22

8. 図表

Figure 1. JAK 阻害剤は破骨前駆細胞の骨表面への遊走を抑制する

(A) LPS により炎症性骨破壊を誘導した TRAP-tdTomato マウスに JAKi を投与して頭頂骨

の生体骨イメージングを行った。赤: TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞、青: 骨 (SHG)。Scale

bar: 50 µm。

(B) Steady state に対する TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞の面積の解析結果。

23

(Steady state: n = 35 images、Vehicle: n = 39 images、JAKi: n = 36 images、 各群 5 匹)。

(C) LPS 投与により炎症性骨破壊を誘導した CX3CR1-EGFP マウスに JAK 阻害剤 (JAKi)

を投与して頭頂骨の生体骨イメージングを行った。緑: CX3CR1-EGFP+ 細胞。Scale bar:

30 µm (上段)。EGFP+ 細胞の動きを 10 分間追跡した。Color line は細胞の軌跡を示す (下

段)。(D) EGFP+ 細胞の平均移動速度を計測した結果。(Steady state: n = 795 cells、Vehicle:

n = 570 cells、JAKi: n = 1091 cells、各群 5 匹) (E) 破骨前駆細胞と骨組織の接着領域の抽

出方法。生体骨イメージングにより 3D イメージング画像を作成した。緑: CX3CR1-EGFP、

青: 骨 (SHG) (左)。3D イメージング画像から破骨前駆細胞領域と骨組織領域を抽出した

(中)。破骨前駆細胞と骨組織が重なった領域 (赤色) を接着領域とした (右)。Scale bar:

100 µm。(F) 骨組織に接着している破骨前駆細胞の割合を解析した。上段は CX3CR1EGFP+ 細胞、中段は CX3CR1-EGFP+ 細胞と骨組織の接着領域、下段は重ね合わせ画像

を示す。緑: CX3CR1-EGFP、赤: EGFP+ 細胞と骨組織の接着領域。Scale bar: 20 μm。(G)

骨組織に接着している破骨前駆細胞の割合の解析結果。(Steady state：3 匹のマウスから

n = 17 images、Vehicle: 3 匹のマウスから n = 15 images、JAKi: 4 匹のマウスから n = 22

images) Error bar は平均値 ± SD を示す。Kruskal-Wallis 検定により統計学的解析を行っ

た。**: P < 0.01, ***: P < 0.001, ****: P < 0.0001.

24

Figure 2. JAK 阻害剤は破骨前駆細胞の Ccr1 の発現を低下させる

(A) JAK 阻害剤 (JAKi) または Vehicle を投与した LPS 誘導炎症性骨破壊モデルマウスか

ら CX3CR1-EGFP+ 細胞を単離し、RNA-seq で解析した。JAKi 投与群で発現量が低下し

た遺伝子の Heatmap を示す。(Fold change < -2, P < 0.05, 各群 3 匹) (B) JAKi 投与群で

発現量が低下した遺伝子の enrichment gene ontology (GO) 解析の結果。ドットの大きさ

は P 値に比例する。(C) ケモカイン受容体および S1pr1, S1pr2 の Heatmap。緑は遺伝子

発現レベルの低下、赤は遺伝子発現レベルの上昇を示す。(各群 3 匹) (D) CX3CR1-EGFP+

細胞における Ccr1 発現を RT-qPCR で解析した。(各群 6 匹) (E) CX3CR1-EGFP+ 細胞に

おける CCR1 発現をフローサイトメトリーで解析した。代表的なヒストグラム (上段) お

よび平均蛍光強度 (Mean fluorescent intensity: MFI) (下段) を示す。(Vehicle: n = 6 mice、

25

JAKi: n = 5 mice)。Error bar は平均値 ± SD を示す。Two-tailed Student’s t-test により統

計学的解析を行った。*: P < 0.05, **: P < 0.01.

26

Figure 3. CCR1 は炎症時に破骨前駆細胞の骨表面への遊走を制御する

(A) LPS により炎症性骨破壊を誘導した CX3CR1-EGFP マウスに CCR1 アンタゴニスト

を投与して頭頂骨の生体骨イメージングを行った。緑: CX3CR1-EGFP+ 細胞。Scale bar:

30 µm (上段)。EGFP+ 細胞の動きを 10 分間追跡した。Color line は細胞の軌跡を示す

(下段)。(B) EGFP+ 細胞の平均移動速度を計測した結果。(Vehicle: n = 589 cells、JAKi:

n = 1281 cells、各群 6 匹) (C) 破骨前駆細胞と骨組織の接着領域を解析した。上段は

CX3CR1-EGFP+ 細胞、中段は CX3CR1-EGFP+ 細胞と骨組織の接着領域、下段は重ね合

わせ画像を示す。緑: CX3CR1-EGFP+ 細胞、赤: EGFP+ 細胞と骨組織の接着領域。

Scale bar: 20 μm。(E) 骨組織に接着している破骨前駆細胞の割合の解析結果。(Vehicle:

n = 26 images、CCR1 antagonist: n = 22 images、各群 3 匹) (F) LPS により炎症性骨破

27

壊を誘導した TRAP-tdTomato マウスに CCR1 アンタゴニストを投与して生体骨イメー

ジングを行った。赤: TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞、青: 骨 (SHG)。Scale bar: 50

µm。(G) TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞の面積の解析結果。(Vehicle: n = 51 images、

CCR1 antagonist: n = 44 images、 各群 6 匹)。Error bar は平均値 ± SD を示す。

Kruskal-Wallis 検定により統計学的解析を行った。**: P < 0.01, ****: P < 0.0001.

28

Figure 4. JAK 阻害剤は炎症により活性化した成熟破骨細胞の機能を抑制する

(A) LPS による炎症性骨破壊を誘導した TRAP-tdTomato マウスに JAK 阻害剤 (JAKi) と

pH 応答性蛍光プローブ (pHocas-3) を投与して生体骨イメージングを行った。緑:

pHocas-3、赤: TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞、青: 骨 (SHG)。矢尻: 酸性領域。Scale bar:

30 µm。(B) 成熟破骨細胞の骨吸収活性の評価方法。イメージング画像を二値化し成熟破

骨細胞領域を抽出した 。成熟破骨細胞領域の 内側 (pHocas-3 のシグナル ) と外側

(pHocas-3 のノイズ) でそれぞれ pHocas-3 の平均蛍光強度を測定した。骨吸収活性

(Bone resorbing index) は、pHocas-3 のシグナルと pHocas-3 のノイズの比として算出し

た。緑: pHocas-3、赤: TRAP-tdTomato+ 成熟破骨細胞。(C) 成熟破骨細胞の骨吸収活性の

解析結果。(Steady state: n＝43 images、Vehicle: n＝40 images、JAKi: n＝38 images、各

群 5 匹) (D) 成熟破骨細胞の形態学的変化の解析方法。 t = 0 の細胞領域 (A+B)、5 分後

(t =5) の細胞領域 (B+C)、およびこれら 5 分間で重なった細胞領域 (B)を抽出し、5 分間

の面積変化 (A+C) を t = 0 の細胞領域 (A+B)で割った比率 (A+C) / (A+B) を Cell

deformation index と定義した。(E) 成熟破骨細胞の形態学的変化の解析結果。 (Steady

state: 3 匹のマウスから n = 32 cells、Vehicle: 3 匹のマウスから n = 36 cells、JAKi: 4 匹

29

のマウスから n = 30 cells)。Error bar は平均値 ± SD を示す。Kruskal-Wallis 検定により

統計学的解析を行った。**: P < 0.01, ***: P < 0.001, ****: P < 0.0001.

30

Figure 5. 骨細胞の採取方法の確立

(A) Collagenase 処理と脱灰処理で得られた細胞から singlet のみを gating して (1, 2)、骨

片などが含まれる自家蛍光を除いた後に (3)、CD31- CD45- TER119- Sytox Red- の細胞を

単離して single cell RNA-seq を行った (4)。(B) single cell RNA-seq の t-SNE プロットの

結果。7 つのクラスターに分類され、遺伝子の特徴から CAR 細胞、骨芽細胞、骨細胞が

含まれることが分かった。(C) CAR 細胞および骨芽細のマーカー遺伝子の発現量を示した

プロット。Cxcl12: CAR 細胞に特徴的な遺伝子。Bglap, Col1a1, Sp7: 骨芽細胞に特徴的

な遺伝子。(D) 骨細胞に発現する特徴的な遺伝子の発現量を示したプロット。

31

Figure 6. 破骨細胞近傍の骨細胞を選択的に標識する方法の確立

(A) 破骨細胞近傍の骨細胞を選択的に光刺激する方法。PA-GFP と TRAP-tdTomato のダ

ブルトランスジェニックマウスの頭頂骨を生体骨イメージングで撮影し、MIP 画像を作

成した (1)。得られた MIP 画像から dTomato のシグナルを二値化することで抽出し、

Dilate 処理および Close hold 処理を行った (2)。領域内を光刺激することで破骨細胞近

傍の細胞を蛍光標識した (3)。(B) 光刺激する領域を決定した後、破骨細胞の直下の骨基

質を光刺激することで破骨細胞近傍の骨細胞を蛍光標識した。

32

業績

発表論文

1. Hashimoto R, Minoshima M, Kikuta J, Yari S, Bull SD, Ishii M, Kikuchi K. An AcidActivatable Fluorescence Probe for Imaging Osteocytic Bone Resorption Activity in Deep

Bone Cavities. Angew Chem Int Ed Engl 2020;59(47):20996-21000.

2. Agemura T, Hasegawa T, Yari S, Kikuta J, Ishii M. Arthritis-associated osteoclastogenic

macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis.

Immunol Med 2022;45(1):22-26.

3. Agemura T, Hasegawa T, Yari S, Kikuta J, Ishii M. Arthritis-associated osteoclastogenic

macrophage, AtoM, as a key player in pathological bone erosion. Inflamm Regen

2022;42(1):17.

4. Koike T, Fujii K, Kometani K, Butler NS, Funakoshi K, Yari S, Kikuta J, Ishii M, Kurosaki

T, Ise W. Progressive differentiation toward the long-lived plasma cell compartment in the

bone marrow. J Exp Med 2023;220(2):e20221717.

5. Yari S, Kikuta J, Shigyo H, Miyamoto Y, Okuzaki D, Furusawa Y, Minoshima M, Kikuchi

K, Ishii M. JAK inhibition ameliorates bone destruction by simultaneously targeting mature

osteoclasts and their precursors. Inflamm Regen 2023;43(1):18.

学会発表

1. 鎗 伸弥, 菊田 順一, 執行 穂高, 石井

優. 生体骨イメージングによる JAK 阻害剤

の in vivo 作用機序の解明. 第 6 回日本骨免疫学会. 2021 年 7 月 1 日.

2. 鎗 伸弥, 菊田 順一, 石井 優. 炎症性骨破壊における JAK 阻害剤の in vivo 作用メ

カニズムの解明. 第 7 回日本骨免疫学会. 2022 年 6 月 30 日.

3. Shinya Yari, Junichi Kikuta, Masaru Ishii. JAK inhibition ameliorates bone destruction by

simultaneously targeting mature osteoclasts and their precursors. The 51st Annual Meeting

of The Japanese Society for Immunology. 2022 年 12 月 9 日.

33

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