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Impaired development and dysfunction of endothelial progenitor cells in type 2 diabetic mice, assessed using a new mouse endothelial progenitor cell colony-forming assay

塚田, 信津 東京大学 DOI:10.15083/0002002726

2021.10.27

概要

【序論】
血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell: EPC）は骨髄において造血幹細胞から分化・増殖後、末梢血中を循環し、障害組織に遊走・定着することで、血管形成や虚血組織の修復に重要な役割を担っている。EPCには様々な分化段階が存在し、血管形成や虚血組織の修復にはEPCの数のみならずコロニー形成能が重要であることから、異なる分化段階にあるEPCのコロニー形成能を評価することができる評価系が求められている。そこで本研究では、異なる分化段階にあるEPCのコロニー形成能を評価することができるコロニーフォーミングアッセイ法をマウスEPCにおいて確立し、下肢虚血モデルマウスを用いて、異なる分化段階にあるEPCのin vivoにおける役割を明確にすることを目的とした。
また、様々な虚血性疾患においてEPCの関与が報告されており、下肢虚血疾患や難治性潰瘍などの患者の虚血組織に自家EPCを移植する細胞治療が臨床応用されている。しかし、老化や糖尿病等の基礎疾患により患者のEPC量及び質が低下し、移植後に十分な治療効果が得られない問題もある。特に、糖尿病患者では健常人に比べて末梢血中を循環するEPCの数及び機能が低下しており、細小血管障害の悪化に関与しているとの報告がなされているものの、実際のEPCの状態、分化能及び機能低下メカニズムが解明されていない。そこで、本研究では、EPCコロニーフォーミングアッセイを用いて、2型糖尿病マウスにおける骨髄細胞の特性解析及びEPCへの分化能や機能を評価することを第二の目的とした。また、糖尿病合併症の悪化にはマクロファージの機能変化を含む炎症反応の増大が関与していることから、2型糖尿病マウスにおける骨髄細胞から顆粒球マクロファージへの分化能も同時に評価した。

【方法・結果・考察】
1. マウスEPCコロニーフォーミングアッセイ法の確立
EPCコロニーフォーミングアッセイ法の検討では、C57BL/6Jマウス（雄、8-10週齢）から末梢血単核球、骨髄単核球及び骨髄細胞KSL画分（c-Kit+/Sca-1+ lineage negative画分）を単離し、メチルセルロース培地MethoCult SF M3236（SCF、VEGF、IL-3、bFGF、EGFR、IGF-1、heparin、10%FBSを含む）で培養した。培養8日後、各種細胞は分化して、形態的に異なる細胞から構成された2種類のEPCコロニーフォーミングユニットを形成し、紡錘形細胞群をlarge-EPC-colony forming unit(CFU)、円形細胞群をsmall-EPC-CFUと定義した（図1A-C）。両EPC-CFUは酸化LDLの取り込み及びレクチンによる染色から、EPCであることが確認された（図1D）。評価方法として、培養後に顕微鏡下で各EPC-CFUを形態的に判別して計測することで、EPCの分化能及びコロニー形成能を評価することが可能となった。次に、large-EPC及びsmall-EPCの機能の違いを検討するため、それぞれを単離して解析を行った。RT-PCRにより血管内皮細胞のマーカー遺伝子の発現を評価したところ、eNOS、Flk-1及びVE-cadherinの発現が確認され、large-EPC及びsmall-EPCは血管内皮細胞の分化系列であることが示された。また、BrdU取り込みによる増殖能評価と接着能評価及び内皮細胞との共培養による管腔形成能評価を行ったところ、large-EPCとsmall-EPCは異なる性質を有していた。large-EPCはsmall-EPCに比べて増殖能は低いものの、接着能及び管腔形成能が高いことから機能的なEPCであることが示された。一方、small-EPCは増殖能が高く、2次培養によりlarge-EPCへと分化したことから、分化初期のEPCであることが示された。さらに、large-EPCとsmall-EPCのin vivoにおける機能を明らかにするため、下肢虚血マウスを用いて評価を行った。下肢虚血処置後のマウスから末梢血単核球及び骨髄細胞を採取し、EPCコロニーフォーミングアッセイを行ったところ、下肢虚血刺激により末梢血単核球及び骨髄細胞からlarge-EPC-CFUへの分化が促進された。この結果から、in vivoにおける下肢虚血刺激はEPCへの分化を促進することが明らかとなり、large-EPCは虚血に対する修復機構に即効的に必要とされる機能的EPCであることが示唆された。また、下肢虚血マウスの下肢虚血部位にlarge-EPC又はsmall-EPCを移植すると、対照群及びsmall-EPC移植群では変化がなかったのに対し、large-EPC移植群では血流改善及び下肢筋組織中の血管数増加が示され、虚血組織の修復作用が認められた（図2）。以上の結果から、マウスEPCコロニーフォーミングアッセイにおいて分化段階の異なるEPCのコロニー形成能を評価することが可能となり、本評価系で培養されるlarge-EPCは分化後期の機能的EPCであり、虚血性疾患における虚血組織の回復に重要な役割を担っていることが示された。（図3）

2. 2型糖尿病マウスにおけるEPCの分化能及び機能解析
上記で確立したEPCコロニーフォーミングアッセイを用いて、2型糖尿病モデルマウス（db/dbマウス及びKKAyマウス）におけるEPCの分化能及び機能解析を行った。2型糖尿病マウスの骨髄細胞について、幹細胞（KSL画分：c-Kit+/Sca-1+ lineage negative）の割合及びBrdU取り込みによる増殖能をフローサイトメトリーを用いて評価したところ、2型糖尿病マウスでは幹細胞であるKSL画分の増殖能が低下しており、骨髄細胞中のKSL画分の割合が減少した。EPCコロニーフォーミングアッセイにおいて分化能を評価したところ、2型糖尿病マウスの骨髄細胞KSL画分では分化後期の機能的EPCであるlarge-EPC-CFUへの分化能が低下した（図4A）。末梢血単核球の分化能についても同様の結果が得られた。また、EPCへの分化能が高い画分であるCD34陽性細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて評価したところ、2型糖尿病マウスの骨髄細胞KSL画分において、CD34陽性細胞の割合が減少した。この結果から、2型糖尿病マウスにおける骨髄細胞KSL画分からlarge-EPC-CFUへの分化能低下の1つの原因として、KSL画分におけるCD34陽性細胞の減少が示唆された。さらに、骨髄細胞KSL画分はEPCや造血細胞などの様々な系列の細胞に分化することができる幹細胞であることから、糖尿病マウスにおける幹細胞の分化傾向を明らかにするため、EPCコロニーフォーミングアッセイと同時に造血前駆細胞コロニーフォーミングアッセイを行った。その結果、2型糖尿病マウスの骨髄細胞KSL画分において顆粒球マクロファージへの分化能が亢進していることが示された（図4B）。以上の結果から、2型糖尿病マウスでは、骨髄細胞のKSL画分が減少することに加え、EPCへの分化能が低下する一方で、顆粒球マクロファージへの分化能が亢進していることが示された。2型糖尿病ではEPCや顆粒球マクロファージへの分化に関して抑制と促進という逆の制御があることが示唆された（図4C）。

【結語】
本研究において、分化段階の異なるEPCのコロニー形成能を評価できるマウスEPCコロニーフォーミングアッセイ法を確立した。また、本評価系において形成されるlarge-EPC-CFUはsmall-EPC-CFUに比べてより成熟した機能的EPCであり、虚血性疾患における虚血組織の回復に重要な役割を担っていることが示された。本評価系を用いて分化初期のEPC（small-EPC-CFU）から分化後期の機能的EPC（large-EPC-CFU）へのEPC分化の分子メカニズムが解明されることにより、EPCを用いた細胞治療における質的・量的課題を解決することが可能になると考えられた。さらに、本評価系を用いて、2型糖尿病マウスでは分化後期EPCのコロニー形成能が低下することが明らかとなり、骨髄細胞KSL画分からEPCや顆粒球マクロファージへの分化に関して抑制と促進という逆の制御があることが示唆された。本研究の成果は、血管障害及び虚血性疾患の患者におけるEPC機能低下のメカニズムの解明や、骨髄細胞及びEPCの機能を回復させる治療薬の開発に有用な知見となると考えられた。

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