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B型肝炎ウイルス制御を目指したHBx–DDB1結合阻害剤の探索

關場, 一磨 東京大学 DOI:10.15083/0002005029

2022.06.22

概要

B型肝炎ウイルス(HBV)の克服は世界的な課題である。約2億4千万人が持続感染していると推定され、毎年約90万人がHBV感染の合併症である肝硬変症や肝細胞癌等により死亡している。長期予後改善のための治療目標として、Functionalcureと呼ばれるHBV表面抗原(HBs抗原)の陰性化が掲げられているが、インターフェロン製剤や核酸アナログ製剤といった現存の治療薬では達成困難であり、新規治療薬の登場が切望されている。

近年、ウイルス蛋白HBV regulatory proteinX(HBx)は宿主蛋白DNA damage binding protein1(DDB1)との結合を介して、宿主蛋白structural maintenance of chromosomes5/6(Smc5/6)を分解し、ウイルス複製の鋳型として肝細胞核内に安定的に存在するHBV covalently closed circular DNA(cccDNA)からのHBVRNA転写を促進するということが報告された。よって、HBx–DDB1結合はウイルス複製における重要なステップであり、その阻害剤はSmc5/6の回復を介してHBVRNA転写抑制剤として働くと考えられた。そこで本論文では、そのスクリーニング系の確立と同定化合物の効果の検証を行ったので報告する。

まず、蛋白–蛋白結合活性を容易に測定すべく、Split luciferaseに着目した。Large Bit(LgBit)およびSmall Bit(Sm Bit)の大小に分割されたルシフェラーゼサブユニット自体同士の結合力は非常に弱いため、その結合はLgBit・SmBitを付加した蛋白同士の結合力に依存する。このLgBit、SmBitが付加されたHBxおよびDDB1を発現するDNAコンストラクトを作製し、HBx–DDB1結合阻害剤スクリーニング系を確立した。この際、LgBitとSmBitの付加位置が効率良いルシフェラーゼ活性に重要であるため、はじめに付加位置の全組み合わせ8種類でルシフェラーゼ活性を比較検討し、HBxのC末端にLgBit(HBx–LgBit)、DDB1のN末端にSmBit(SmBit–DDB1)を付加した組み合わせが最適であることを見出した。また、このスクリーング系は系の精度の最重要指標とされるZ’スコア0.5以上を満たしていた。

本研究においては、臨床応用への近道とされるドラッグリポジショニングを目指して、817種類のアメリカ食品医薬品局(FDA)承認済み化合物で構成される化合物ライブラリーをスクリーニング対象とした。HEK293T細胞株を用いた1次スクリーニングでは、817化合物中5化合物(トレミフェン、ロペラミド、ピモジド、ビンブラスチン、ニタゾキサニド(NTZ))で有意な阻害活性を得た。細胞株をHepG2に変えた2次スクリーニングでは、5化合物のうちNTZのみが有意な阻害活性を示した。NTZのこの阻害効果はHEK293T細胞およびHepG2細胞のどちらにおいても投与濃度依存的であった。また、細胞障害性は低いことは細胞毒性試験により示され、そのHBx–DDB1結合阻害効果は殺細胞に基づくものではないと考えられたため、以降の研究はNTZに着目して行うこととした。

次に、NTZのHBx–DDB1結合阻害効果を、抗FLAGタグ抗体を用いた免疫沈降法で検証した。FLAGタグを付加したHBxを強制発現させ、それに結合する内因性DDB1の量を免疫沈降-ウェスタンブロット法で検証したところ、NTZの投与によって共沈するDDB1の量は有意に低下した。また、GSTタグ付きDDB1(GST-DDB1)リコンビナント蛋白とタグ無しHBxリコンビナント蛋白を用いてin vitro GSTプルダウンアッセイを行ったところ、NTZの投与はGST-DDB1に結合するHBxの量を有意に低下させた。ここまでの結果により、Split luciferaseの実験系で想定された通り、NTZはHBx–DDB1結合を直接的に阻害すると考えられた。

NTZのHBx–DDB1結合阻害効果がSmc5/6の分解阻害に繋がるか検証すべく、HBx定常発現細胞を作製した。この細胞においては、既報通りSmc5/6が有意に分解されるが、NTZの投与によりSmc5/6は有意な発現回復を得た。なお、HBx発現のない細胞においてはNTZの投与によるSmc5/6の発現増強効果は認められなかった。

そこで、次の段階として、NTZのウイルスRNA転写抑制効果をHBV擬似複製系で検証した。HBV擬似複製系としては、近年報告されたminicircleDNA技術を用いた。minicircleDNAは特殊に設計された親プラスミドから目的配列のみを環状に抽出して得るDNAベクターであり、目的配列をHBVゲノムとした場合にはcccDNAを近似することができる。このminicircleHBVDNAを用いた実験系において、NTZの投与は有意にminicircleDNA由来ウイルスRNAの量を低下させた。この効果は既存薬である核酸アナログ製剤(エンテカビル)やインターフェロンα2aよりも高いものであった。また、点変異導入によりHBx発現を欠損させた変異minicircleDNAにおいては、NTZはHBVRNA転写抑制効果を示さなかったが、この変異minicircleDNAをHBx定常発現細胞に導入した際には、その抗ウイルス効果は回復した。よって、NTZの効果はHBx依存的なものと考えられた。

また、他のHBV擬似複製系として、ゲノムにHBV配列が組み込まれ、テトラサイクリンにてその発現を制御できるHepAD38細胞株も用いた。この実験系においても、同様にNTZは有意なHBVRNA転写抑制効果を示した。

さらに、minicircle DNAを用いて、NTZ投与のウイルス蛋白量に与える影響を検証したところ、NTZの投与により有意なウイルス蛋白減少を認めた。また、cccDNA量に関してもNTZの投与により、わずかではあるが有意差をもって減少効果を認めた。これはNTZの投与によるpregenomic RNAの減少が新規に形成されるcccDNA量の減少につながった可能性や、HBx蛋白の減少がcccDNAの不安定性をもたらした可能性などが理由として考えられた。

ここまでの結果より、NTZはHBV擬似複製系において有意な抗ウイルス効果を有することが示されたため、最後は、初代ヒト肝細胞を用いたHBV感染系でその効果を検証した。初代ヒト肝細胞はヒト肝細胞キメラマウスから単離された肝細胞で、HBVに感染し、その生活環を再現する。HBV感染後、5日間NTZの投与を行ったところ、Smc5は有意な回復を認め、それに伴いHBVRNA量は有意に低下した。さらにウイルス蛋白は上清中および細胞内共に減少を認め、上清中HBVDNA量も有意な減少を認めた。ccc DNAについても、NTZの投与は、minicircle DNAでの実験系と同様に、部分的ではあったが有意な減少をもたらした。よって、NTZはHBV感染系においても有意な抗ウイルス効果を発揮することが示された。

以上、本研究では、Split luciferaseによるHBx–DDB1結合阻害剤のスクリーニング系を確立し、同定化合物NTZの抗ウイルス効果を実証した。NTZはHBx–DDB1結合阻害によるSmc5/6の回復を通して、抗HBV効果を発揮する。今回同定したNTZの抗HBV効果はHBV functional cureの実現に向けた新規治療薬の開発に繋がる可能性がある。

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