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亜鉛による蛋白質機能発現制御とそれを標的としたケミカルプローブの検討

古賀, 涼子 東京大学 DOI:10.15083/0002004203

2022.06.22

概要

緒論
亜鉛は生体内に2番目に多い金属元素であり、亜鉛蛋白質や亜鉛イオンとして存在している。亜鉛は、亜鉛蛋白質の構造保持と機能制御に密接に関与している。本研究では2つの蛋白質を対象にして、蛋白質の機能制御における亜鉛の役割について明らかにし、知見を得ることを目指した。亜鉛と蛋白質機能との関係が未知であるHIV-2Vpx/Vprについて分子生物学的手法を、亜鉛フィンガーをもつ蛋白質であるTRAF6についてケミカルバイオロジー的手法を用いて研究を行った。

1.HIV-2Vpx/Vprの亜鉛結合モチーフと蛋白質発現量との関係
背景と目的
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)はHIV-1とHIV-2に分類され、そのゲノム構造および病原性が異なることが知られている。HIVがもつ蛋白質のうち、アクセサリー蛋白質(Vif・Vpr・Nef・Vpu・Vpx)はHIVの複製・存続・病原性発現に関わるさまざまな機能をもつ。HIV-2はVpxとVprをもつが、HIV-1はVprしかもたない。HIV-2VprはVpxとホモロジーが高く、3つのヘリックスをもつと予測される。近年、Vpxは亜鉛をもつことが明らかとなった。その亜鉛結合モチーフはH39H82C87C89で構成され、それらアミノ酸残基への変異導入によりVpx発現量が減少した。HHCCモチーフをもたないVprはVpxとホモロジーが高いにも関わらず、その発現量はVpx発現量よりも低いことが知られていたが、その理由は不明であった。そこで、亜鉛結合モチーフと発現量の関係に着目し、HIV-2Vprの低発現量は亜鉛と関連があるという仮説を立て、実験を行った。

亜鉛結合モチーフとHIV-2Vpr蛋白質発現量
HIV-2の代表的な分離株の1つであるGH-1株のVprとVpxのアミノ酸配列アライメントを行うと、Vpxの亜鉛結合モチーフに対応するVprのアミノ酸はH38H76C81R83であった。そこでGH-1株の発現ベクターを基にして、R83C(HHCRをHHCCモチーフに変換した)変異体発現ベクターを構築した。各発現ベクターを293T細胞へ導入し、得られた細胞破砕液のウエスタンブロット解析からR83C変異体におけるVpr蛋白質発現量上昇を見出した。亜鉛結合モチーフの重要性を確認するために、R83Cに加えてモチーフ様部位を構成する他のアミノ酸に変異を導入して発現量を検討した。R83C変異を有するにも関わらず、他のアミノ酸への変異導入によりVpr発現量が減少した。よって亜鉛結合モチーフHHCCが存在する場合にVpr蛋白質の発現が高くなることが示された。HIV-2の41分離株のアミノ酸アライメントから、亜鉛結合モチーフ様部位のアミノ酸配列パターンは約90%がHHCHまたはHHCRであった。HHCHパターンである2つのHIV-2分離株と、HIV-2と分子系統学的に同グループに属するサル免疫不全ウイルス(SIV)であるSIVmac分離株のVprの発現ベクターおよびHHCCを導入した変異体を構築し、発現量を調べた。その結果、亜鉛結合モチーフHHCCの導入によってHIV-2グループ分離株のVpr発現量上昇が確認された。

発現量上昇のメカニズム
Vpr発現量上昇のメカニズム検討のために転写・翻訳段階と蛋白質安定性を調べた。野生型とR83C変異体発現ベクターから産生されるmRNA量に大きな差は見られなかった。試験管内転写・翻訳システムを用いた実験から、翻訳効率上昇が考えられた。また、シクロヘキシミドを用いて各発現ベクターから産生されたVpr蛋白質の分解の経時変化から、R83C変異体は安定化していることが示された。次に、野生型およびR83C変異体のMG132処理下での発現量が上昇したことから、いずれもプロテアソーム分解されることが分かった。Vprに存在する2つのリジン残基を変異させた変異体(2KR)と野生型を用いて発現量・ユビキチン化・プロテアソーム分解について調べると、野生型と2KR変異体は同程度の発現量であり、いずれもユビキチン化・プロテアソーム分解されることが明らかになった。従ってVprはリジン残基以外の残基でユビキチン化が生じ、プロテアソーム分解されることが示唆された。

HIV-2全長ゲノムクローンを用いたVpr低発現量の意義の検討
vpr遺伝子の5’端側にHAタグ配列を導入した全長ゲノムクローン(HIV-2GH-1株に基づいたクローン)を構築し、ウエスタンブロット解析を行ってR83C変異導入によるHIV-2Vpr発現量上昇を確認した。また、発現量上昇に伴ってR83C変異体では野生型と比較して多くのVpr蛋白質がウイルス粒子中に取り込まれていた。レポーターアッセイを用いて転写活性について検討すると、全長ゲノムクローンから産生される量と同程度のVpr量の場合にNF-Bによる転写活性が抑制されていた。続いて産生・放出されるウイルス蛋白質量をp27ELISAにて測定したところ、R83C変異体またはVpr欠損体と比べて野生型ではウイルス蛋白質量が減少した。

考察
以上の結果から、HIV-2Vprは亜鉛結合モチーフHHCCをもたないことによって発現量を低く保つと考えられた。HHCCをもつR83C変異体では翻訳効率と蛋白質安定性の上昇が見られた。Vprは構造中に亜鉛を有することによって蛋白質のフレキシビリティが減少して発現量が上昇すると推測される。また、野生型Vprはその適切な発現量によりウイルスや宿主のNF-Bの転写活性を抑制することが示唆された。Vpr/Vpxは共通の祖先から進化してきたウイルス蛋白質であり、宿主への適応・進化の過程で多様な機能を持つようになったと考えられる。蛋白質にはその機能に応じた適切な発現量があるため、Vpr/Vpxは亜鉛を用いるという簡便な方法で発現量調節を行う戦略をとったのではないかと推定している。

2.TRAF6の亜鉛結合モチーフを標的としたケミカルプローブの検討
背景と目的
TRAF6は、IL-1誘導性NF-B活性化を含む細胞内シグナル伝達経路の上流に位置する蛋白質である。TRAF6のもつE3リガーゼ活性は、TRAF6自身およびシグナル蛋白質のK63ユビキチン化に働き、シグナル伝達の足場となるため重要である。TRAF6の蛋白質構造はN端側からRING、亜鉛フィンガー、CoiledcoilおよびTRAF-Cドメインとなっており、RINGドメインに2つ、亜鉛フィンガードメインに少なくとも4つの亜鉛を含むとされる。これまでの分子生物学的研究から、亜鉛フィンガーへの変異導入によるTRAF6ユビキチン化の阻害が示されている。また、RINGドメインと亜鉛フィンガーを含む変異体はRINGドメインのみの変異体よりもE2であるUbc13/Uev1aとより強く相互作用するとの報告がある。これらの結果は亜鉛フィンガーがTRAF6の機能において重要であることを示している。ここでは亜鉛に結合するケミカルプローブを用いたTRAF6亜鉛結合モチーフの機能解析を行った。

SN-1とTRAF6の結合の確認
TRAF6亜鉛結合モチーフに対するケミカルプローブとして、さまざまな亜鉛蛋白質との相互作用が示されているSN-1およびその類縁体を用いることとした。まず、基本骨格であるSN-1とTRAF6の結合をMOEによるドッキングシュミレーションで検討した。SN-1はTRAF6のRINGドメインには結合せず、亜鉛フィンガーと結合することが示された。さらに、ビオチン化SN-1とTRAF6発現ベクターを293T細胞に導入して得られた細胞破砕液を用いてプルダウン実験を行った。その結果、試験管内におけるSN-1とTRAF6の結合を確認した。

ケミカルプローブの選定
10種類のSN-1類縁体の中で本実験にもっとも適したケミカルプローブを検討するために、レポーターアッセイを行った。B配列下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子をもつ発現ベクターと、-actinプロモーター下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をもつ発現ベクターを、IL-1受容体をもつHeLaS3細胞に導入し、化合物を添加後にIL-1によりシグナルを誘導した。得られた細胞破砕液を用いてルシフェラーゼ活性を測定すると、4つの化合物がNF-B活性化阻害効果を示し、その中でSN-2は最も強いNF-B活性化阻害を示した。さらにMTT試薬を用いて細胞毒性評価を行った結果、この実験条件下ではSN-2は細胞毒性を示さなかった。SN-2は細胞内で還元されてSN-1になると考えられるので、本実験に有用であると考えられた。

SN-1を用いたTRAF6の機能制御
SN-1による亜鉛結合モチーフを標的としたTRAF6の機能制御について検討するために、TRAF6自己ユビキチン化を観察した。まず、TRAF6発現ベクターを293T細胞へ導入し、得られた細胞破砕液を免疫沈降してTRAF6蛋白質を得て、試験管内ユビキチン化実験を行った。細胞実験では、まず293T細胞内で起こるユビキチン化に対してSN-2添加による影響がないことを確認した。続いてTRAF6発現ベクターとユビキチン発現ベクターまたはその変異体を293T細胞へ共導入した。SN-2で処理した後に細胞破砕液を得て、免疫沈降・ウエスタンブロット解析を行った。その結果、試験管内ユビキチン化実験と細胞実験のどちらにおいてもSN-1によりTRAF6ポリユビキチン化が抑制された。また、TRAF6のE3リガーゼ活性への影響を検討するため、TAK1ユビキチン化を観察した。TRAF6発現ベクター、TAK1発現ベクターおよびユビキチン発現ベクターまたはその変異体を用いてTRAF6ユビキチン化の細胞実験と同様に行った。TAK1ユビキチン化もTRAF6同様に抑制されたことから、SN-1によるTRAF6のE3リガーゼ活性抑制が示された。SN-2添加時のIL-1誘導性NF-B活性化経路におけるシグナル蛋白質の経時変化を確認すると、SN-2添加時にIKK上流においてシグナル伝達が阻害されていた。また、そのNF-B活性化阻害効果はMG132と同程度であった。

考察
以上の結果からSN-1はTRAF6亜鉛フィンガーに結合してE3リガーゼ活性・ユビキチン化を抑制すると考えられる。TRAF6亜鉛フィンガーの機能は分子生物学的手法により研究されていたが、本研究で用いたケミカルプローブSN-1によってケミカルバイオロジー的研究からも支持できることを明らかにした。またSN1を基盤として、TRAF6認識部位の導入による特異的阻害剤研究にも発展すると考えられる。

総括
本研究では、2つの異なるアプローチを用いて蛋白質のもつ亜鉛の役割を検討した。HIV-2Vpx/Vprの研究から、ウイルス蛋白質発現量制御という亜鉛による新しい機能制御を示すことができた。またケミカルプローブSN-1を用いた研究からは亜鉛によるTRAF6機能制御をケミカルバイオロジー技術から示すことができた。これらの知見は亜鉛によってコントロールされる蛋白質機能の解明の一助となると考えられる。

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