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Staurosporine and venetoclax induce the caspase-dependent proteolysis of MEF2D-fusion proteins and apoptosis in MEF2D-fusion (+) ALL cells

Tange, Naoyuki 丹下, 直幸 名古屋大学

2020.11.10

概要

【緒言】
　特定の蛋白を標的とした治療開発は、酵素を標的としたキナーゼ阻害薬や細胞表面蛋白を標的とした抗体薬の開発が先行しており、細胞内蛋白である転写因子や足場蛋白を標的とした新薬の開発は遅れている。Myocyte enhancer factor 2D (MEF2D) 融合遺伝子は思春期・若年成人を中心に B 細胞性急性リンパ性白血病（ALL）の約 5%を占める遺伝子異常である。MEF2D 融合蛋白をマウス骨髄細胞へ導入するとコロニー形成能が増加するとの報告や、NIH3T3 細胞へ導入すると形質転換が起こるとの報告があり、MEF2D 融合蛋白は白血病の生存に有利に働くと考えられている。また、 microRNA の制御を回避することで MEF2D 融合蛋白が高発現となり、B 細胞分化のマスター因子である PAX5 の転写活性を抑制することで分化停止を起こすと考えられている。以上の背景より、MEF2D 融合蛋白を減少させる薬剤が抗白血病効果を有すると考え、標的蛋白の分解を誘導する化合物のスクリーニングシステムを開発した。

【方法と結果】
　MEF2D 融合遺伝子の共通配列である N 末端側 203aa とホタル Luciferase の融合蛋白を安定発現する 293T 細胞（ MEF2D N-Luc/293T）を作成した。同様に Luciferase蛋白を安定発現する 293T 細胞（ Luc/293T） を作成した。これらの細胞を用いて Luciferase assay を行う事で、MEF2D N-Luc 融合蛋白、Luciferase 蛋白の蛋白量の簡便な定量が可能となり、MEF2D N 配列に特異的な蛋白分解を誘導する化合物を同定する薬剤のスクリーニングシステムを構築した（Fig1A）。既知活性物質ライブラリ（3766化合物）を用いてスクリーニングを行い、MEF2D N-Luc/293T の Luciferase 活性を低下させ、Luc/293T の Luciferase 活性を低下させない化合物として、Staurosporine とその類縁体である K252a の 2 剤を同定した（Figure 1.B.C）。同定した 2 剤の投与により、実際に MEF2D N-Luc 蛋白が濃度依存的に減少しており、スクリーニングにより目的とする化合物が選別されたことを確認した（Figure 1.D.E）。
　MEF2D-HNRNPUL1 (M-H)融合遺伝子陽性 ALL 細胞株である Kasumi-7、Kasumi-9、 MEF2D-DAZAP1 (M-D)融合遺伝子陽性ALL 細胞株であるTS-2 に対して、Staurosporine、 K252a は用量依存的に M-H、M-D 蛋白量を減少させる効果を示した（Figure 2.A.B）。 Staurosporine は様々な癌種に対してアポトーシスをもたらすマルチキナーゼ阻害剤として知られている。我々は、Staurosporine、K252a による MEF2D 融合蛋白の減少が抗白血病効果を増強させると仮定し ALL 細胞株に対する薬効を調べた。予想通り、 MEF2D 融合遺伝子陰性株（NPHA1、ALL1、Daudi）に比較して、陽性株（Kasumi-7、 Kasumi-9、TS-2）に対して選択的な抗白血病効果を認めた（Figure 3.A.B）。
　次に Staurosporine の MEF2D 融合蛋白減少メカニズムの検討を行った。Kasumi-7 での M-H 蛋白量減少効果は、プロテアソーム阻害剤、オートファジー阻害剤の併用では阻害されず、システインプロテアーゼ阻害剤（ Z-VAD-FMK）の併用で阻害された（Figure 4.A）。Z-VAD-FMK の併用により、caspase-3, caspase-7, PARP の切断が阻害された（Figure 4.B）。ミトコンドリアを介したカスペースの活性化を阻害する Bax channel blocker の併用でも同様に caspase-3, caspase-7, PARP の切断が阻害された（Figure 4.C）。 Z-VAD-FMK, Bax channel blocker の併用により、Staurosporine による Kasumi-7 のアポトーシス誘導が阻害された（Figure 4.D.E）。以上の結果から、Staurosporine はカスペース依存的に MEF2D 融合蛋白を減少させ、アポトーシスを誘導している可能性が示唆された。
　カスペースによる M-H 蛋白の切断部位を検討するため、切断候補部位であるアスパラギン酸をグルタミン酸に置換した変異 M-H 蛋白発現ベクターを作成し、In vitro cleavage assay を行った（Figure 5.A）。In vitro において、M-H 蛋白は caspase-3、caspase- 7 によって切断され、切断点は D125 であった（Figure 5.B）。さらに、TS-2 細胞に発現させた D125E 変異 M-H 蛋白は、Staurosporine 投与による蛋白減少を回避しており、 Staurosporine による M-H 蛋白の減少メカニズムはカスペースの活性化による D125 での切断と考えられた（Figure 5.C）。MEF2D 融合遺伝子陽性株におけるカスペース活性化と MEF2D 融合蛋白減少の時間的関係を詳細に検討したところ、両者は Staurosporine投与後ほぼ同時に（1 時間後）に始まり、MEF2D 融合蛋白減少の後カスペース活性化が増強していることが示された（Figure 5.D）。このことは MEF2D 融合蛋白の減少はカスペース活性化に誘導されるものでありながら、これを増強する作用があり、両者は feed-forward loop を形成していることを示唆している。
　Staurosporine 同様カスペースを活性化する作用があり、すでに臨床応用が進んでいる Venetoclax にも MEF2D 融合蛋白減少効果と抗白血病効果があるかを調べた。期待した通り、MEF2D 融合遺伝子陽性株に対し、MEF2D 融合蛋白を減少させ、MEF2D 融合遺伝子陰性株を上回る抗白血病効果を認めた（Figure 6.A.B）。

【考察】
　転写因子を標的とした治療開発は困難であったが、proteolysis-targeting chimeric molecules (PROTACs)といった新たな技術が開発されている。当初睡眠薬として開発され多発性骨髄腫の治療に用いられている Thalidomide は、CUL4 ユビキチンリガーゼ複合体成分の cerebron へ選択的に結合し、転写因子 Ikaros の分解を促進することが明らかとなった。同様に、抗癌剤として開発が進んだスルホンアミド化合物 indislam は、 CRL4 ユビキチンリガーゼ複合体成分の DCAF15 へ選択的に結合し、CAPERα の分解を促進することが再発見された。これらのことからも、標的蛋白の分解を誘導する化合物が既存薬の中から再発見される可能性があり、今回我々が開発した Luciferase assay を用いたスクリーニングシステムが応用できる可能性がある。

【結語】
　我々は標的蛋白の分解を誘導する化合物のスクリーニングシステムを新規に開発した。Staurosporine、Venetoclax がカスペース依存的に MEF2D 融合蛋白を分解させる効果があり、ALL に対する臨床応用の可能性を見出した。

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