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Dermatan sulphate is an activating ligand of anaplastic lymphoma kinase

町野, 正明 名古屋大学

2022.04.25

概要

【緒言】
未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)は、受容体型チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーに属する I 型膜貫通型タンパク質であり、その細胞内チロシンキナーゼ活性は、特定のリガンドによる受容体クラスタリングによって増強される。ALK の強力な生物活性は、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)における t(2; 5)(p23; q35)染色体転座によってヌクレオフォスミン(NPM-ALK)に融合した ALK が産生されたときに最初に発見された。

2015 年に Murray らは、ヘパラン硫酸(HS)とその過硫酸化部分ヘパリン(HP)は、 ALK の新規活性化リガンドであると報告した。HS はコンドロイチン硫酸(CS)、デルマタン硫酸(DS、CS-B としても知られている)、およびケラタン硫酸(KS)とともに、グリコサミノグリカン(GAG)として分類される分岐を欠く線状糖鎖である。GAG は、 RTK のような受容体のクラスタリング制御において重要であり、不均一な硫酸化を伴う反復二糖ユニットで構成されている。更に Murray らは、鎖長の短い HP は ALK を活性化しなかったが、より長いヘパリン鎖は ALK の二量体形成と活性化を誘導したと報告した。また HS フォームとして、ALK の N 末端領域(NTR)との相互作用に十分な HS は八糖型であることを示した。

本研究は、HS と同じように CS または DS など他の GAG も ALK のリガンドであるかどうかを検証することを目的とした。

【方法】
表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance, SPR)
BIACORE X-100(GE Healthcare)を使用して実施した。SPR 分析は、表面への分子の吸脱着挙動を金属表面近傍の屈折率変化として非標識かつリアルタイムで追跡できる方法である。ALK の NTR(Proteintech)は、CM5 センサーチップに固定化され、ALK の NTR と CS、DS との相互作用を検証した。異なる硫酸化パターンの CS および DS の溶液(20µg/mL)を分析対象物として注入した。速度論的解析では、分析対象物の段階希釈(0、1.6、8、40、200、および 1000 nM)を 30μl/分で再生せずに連続的に注入した。結合パラメーターは、1：1 結合フィッティングモデルで計算され、すべての GAG の分子量は 10,000 と推定された。

Sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)
神経芽細胞腫細胞株 NB-1 を 18 時間血清飢餓状態にして、DS にて 15 分間刺激した。NB-1 に異なる濃度の DS を投与し、ALK とリン酸化 ALK の発現を Western blotting法にて確認した。デンシトメトリー分析は、ImageJ ソフトウェアを使用して 220 kDaの分子量(p220-ALK)のバンドの定量化を行った。

免疫細胞化学的分析(Immunocytochemistry, ICC)
NB-1 細胞を 18 時間血清飢餓状態にした後、2.5 µM の DS で 15 分間刺激した。NB-1に DS 十六糖(dp16)を投与し、リン酸化 ALK の発現を免疫染色にて観察した。画像はBZ-9000 顕微鏡(KEYENCE)で撮影した。

Pull-down assay
全長 ALK および NTR を欠く短縮型 ALK(ALKΔNTR)を HEK293T 細胞に 2 日間過剰発現させ、免疫沈降法にてタンパク質間の相互作用を検証した。全長 ALK はビオチン結合化 DS によって正常にプルダウンされるか、DS が ALK の特異的リガンドであるかを確認した。

【結果と考察】
ALK の NTR 上の塩基性アミノ酸クラスターは、イオン結合を介して HS と相互作用することが報告されている(図 1A)。SPR 分析にて、DS は ALK の NTR との有意な相互作用を示したが、他の硫酸化パターンを含む CS フォームは ALK に結合しなかった(図 1B)。ALK の NTR と CS または DS の間の相互作用の速度論的解析では、センサーグラムのカーブから DS と ALK の間のみ有意な相互作用を示した。DS と ALK の親和性の指標となる解離定数(KD)は、2.922×10-8 M であった。他の硫酸化パターンを含む CS フォームは ALK と一定の親和性を示さなかった(図 1C および 1D)。

内在性に ALK の発現を認める NB-1 細胞において、DS が ALK を活性化するかどうか検証した。Western blotting 法にて DS 二糖(dp2)を除いて、DS 四糖(dp4)より長い DSは、ALK の自己リン酸化を用量依存的に誘導し、ALK の活性化を促した(図 2A-D)。 5 µM では ALK を活性化しなかったが、天然 DS を使用しても同様の結果が得られた (図 2E)。デンシトメトリー分析にて図 2A から E の定量化を行い、ALK に対するリン酸化 ALK の比率をプロットした。dp4 より長い DS は ALK の自己リン酸化を濃度依存的に誘導し ALK を活性化した(図 2F)。NB-1 細胞を 2.5 µM の DS で刺激し、鎖長が長いほど ALK の活性化が強くなった(図 2G)。ヘパリンの場合と同様に、より長い糖鎖は ALK のより強い自己リン酸化を誘導し、より長い DS が ALK のクラスタリングを促進する傾向があることを示した(図 2H)。注目すべきことに、同じ濃度の DS 十六糖(dp16)と HP 二十糖(dp20)は、同様のレベルで ALK の活性化を誘導した(図 2I)。

140 kDa の ALK(p140-ALK)は、選択的転写開始、細胞外切断、または選択的スプライシングの結果によって生成される短縮型 ALK であり、これらのアイソフォームのいくつかは NTR を欠いていると報告されているため、まだ特徴付けられていない。本実験では、特に高濃度の DS によって、ALK がリン酸化されていた。更なる研究が必要であるが、NTR は DS の主な特異的結合部位であることが示された。

免疫細胞化学的分析にて、NB-1 細胞に DS dp16 投与することでリン酸化 ALK のシグナルが亢進し、DS が ALK のリガンドであることを確認した(図 3)。

ALK の NTR の重要性にさらに取り組むために、全長 ALK と NTR を欠く短縮型 ALK(ALKΔNTR)を HEK293T 細胞に過剰発現させた。その後、細胞溶解物をビオチン結合 DS と混合し、ストレプトアビジンでプルダウンした。ALKΔNTR は DS によってプルダウンされず、全長 ALK は DS によって正常にプルダウンされた。これにより DS が ALK の NTR の特異的リガンドであることを確認した(図 4A)。2.5 µM の DS dp16および天然 DS は、全長の ALK を活性化したが、一貫して ALKΔNTR の活性化を誘導できなかった(図 4B および 4C)。これにより ALK 上の NTR が DS の強い結合部位であることを結論付けた。

本研究によって、DS が ALK の特異的リガンドであることを示された。ALK は、細胞内領域にチロシンキナーゼドメインを含み、中枢神経系と末梢神経系の両方で発現する RTK である。また DS はデコリンやバイグリカンなどのコアタンパク質に結合しプロテオグリカンとして複合体を形成しており、それらは皮膚、血管、骨、神経系に多く存在している。DS は HS と ALK 結合部位を共有しており、糖鎖が長いほど HS よりも高い活性を示した。HS 八糖は ALK 活性化に十分であったが、DS 四糖も ALK 活性化に十分であった(図 4D)。興味深いことに、CS は ALK に対して親和性を示さなかった。DS と CS の違いは、存在するウロン酸(UA)の形態であり、DS にはイズロン酸 (IdoA)が含まれ、CS にはグルクロン酸(GlcA)が含まれる。注目すべきことに、HS の一部には UA コンポーネントとして IdoA が含まれている。このことから、本研究結果は、IdoA が ALK による認識の重要な要素である可能性があることを示唆している。

【結論】
DS が ALK の新しいリガンドであることが証明された。DS は ALK の NTR と直接相互作用し、DS 四糖は ALK の活性化に十分な誘導能を示した。

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1. Hallberg, B. and Palmer, R.H. (2013) Mechanistic in- sight into ALK receptor tyrosine kinase in human can- cer biology. Nat. Rev. Cancer 13, 685–700

2. Morris, S.W., Kirstein, M.N., Valentine, M.B., Dittmer, K.G., Shapiro, D.N., Saltman, D.L., and Look, A.T. (1994) Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin’s lymph- oma. Science 263, 1281–1284

3. Shiota, M., Fujimoto, J., Semba, T., Satoh, H., Yamamoto, T., and Mori, S. (1994) Hyperphosphorylation of a novel 80 kDa protein-tyrosine kinase similar to Ltk in a human Ki-1 lymphoma cell line, AMS3. Oncogene 9, 1567–1574

4. Rikova, K., Guo, A., Zeng, Q., Possemato, A., Yu, J., Haack, H., Nardone, J., Lee, K., Reeves, C., Li, Y., Hu, Y., Tan, Z., Stokes, M., Sullivan, L., Mitchell, J., Wetzel, R., Macneill, J., Ren, J.M., Yuan, J., Bakalarski, C.E., Villen, J., Kornhauser, J.M., Smith, B., Li, D., Zhou, X., Gygi, S.P., Gu, T.L., Polakiewicz, R.D., Rush, J., and Comb, M.J. (2007) Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kin- ases in lung cancer. Cell 131, 1190–1203

5. Soda, M., Choi, Y.L., Enomoto, M., Takada, S., Yamashita, Y., Ishikawa, S., Fujiwara, S., Watanabe, H., Kurashina, K., Hatanaka, H., Bando, M., Ohno, S., Ishikawa, Y., Aburatani, H., Niki, T., Sohara, Y., Sugiyama, Y., and Mano, H. (2007) Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature 448, 561–566

6. Takeuchi, K., Soda, M., Togashi, Y., Ota, Y., Sekiguchi, Y., Hatano, S., Asaka, R., Noguchi, M., and Mano, H. (2011) Identification of a novel fusion, SQSTM1-ALK, in ALK-positive large B-cell lymph- oma. Haematologica 96, 464–467

7. Kelly, L.M., Barila, G., Liu, P., Evdokimova, V.N., Trivedi, S., Panebianco, F., Gandhi, M., Carty, S.E., Hodak, S.P., Luo, J., Dacic, S., Yu, Y.P., Nikiforova, M.N., Ferris, R.L., Altschuler, D.L., and Nikiforov, Y.E. (2014) Identification of the transforming STRN-ALK fusion as a potential therapeutic target in the aggressive forms of thyroid cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 4233–4238

8. Chen, Y., Takita, J., Choi, Y.L., Kato, M., Ohira, M., Sanada, M., Wang, L., Soda, M., Kikuchi, A., Igarashi, T., Nakagawara, A., Hayashi, Y., Mano, H., and Ogawa, S. (2008) Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature 455, 971–974

9. George, R.E., Sanda, T., Hanna, M., Fro¨hling, S., Luther, W., Zhang, J., Ahn, Y., Zhou, W., London, W.B., McGrady, P., Xue, L., Zozulya, S., Gregor, V.E., Webb, T.R., Gray, N.S., Gilliland, D.G., Diller, L., Greulich, H., Morris, S.W., Meyerson, M., and Look, A.T. (2008) Activating mutations in ALK pro- vide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature 455, 975–978

10. Mosse´, Y.P., Laudenslager, M., Longo, L., Cole, K.A., Wood, A., Attiyeh, E.F., Laquaglia, M.J., Sennett, R., Lynch, J.E., Perri, P., Laureys, G., Speleman, F., Kim, C., Hou, C., Hakonarson, H., Torkamani, A., Schork, N.J., Brodeur, G.M., Tonini, G.P., Rappaport, E., Devoto, M., and Maris, J.M. (2008) Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature 455, 930–935

11. Christensen, J.G., Zou, H.Y., Arango, M.E., Li, Q., Lee, J.H., McDonnell, S.R., Yamazaki, S., Alton, G.R., Mroczkowski, B., and Los, G. (2007) Cytoreductive antitumor activity of PF-2341066, a novel inhibitor of anaplastic lymphoma kinase and c-Met, in experimental models of anaplastic large-cell lymphoma. Mol. Cancer Ther. 6, 3314–3322

12. Kwak, E.L., Bang, Y.J., Camidge, D.R., Shaw, A.T., Solomon, B., Maki, R.G., Ou, S.H., Dezube, B.J., Ja¨nne, P.A., Costa, D.B., Varella-Garcia, M., Kim, W.H., Lynch, T.J., Fidias, P., Stubbs, H., Engelman, J.A., Sequist, L.V., Tan, W., Gandhi, L., Mino- Kenudson, M., Wei, G.C., Shreeve, S.M., Ratain, M.J., Settleman, J., Christensen, J.G., Haber, D.A., Wilner, K., Salgia, R., Shapiro, G.I., Clark, J.W., and Iafrate, A.J. (2010) Anaplastic lymphoma kinase inhib- ition in non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 363, 1693–1703

13. Iwahara, T., Fujimoto, J., Wen, D., Cupples, R., Bucay, N., Arakawa, T., Mori, S., Ratzkin, B., and Yamamoto, T. (1997) Molecular characterization of ALK, a receptor tyrosine kinase expressed specifically in the nervous system. Oncogene 14, 439–449

14. Vernersson, E., Khoo, N.K., Henriksson, M.L., Roos, G., Palmer, R.H., and Hallberg, B. (2006) Characterization of the expression of the ALK receptor tyrosine kinase in mice. Gene Expr. Patterns 6, 448–461

15. Bazigou, E., Apitz, H., Johansson, J., Lore´n, C.E., Hirst, E.M., Chen, P.L., Palmer, R.H., and Salecker, I. (2007) Anterograde Jelly belly and Alk receptor tyro- sine kinase signaling mediates retinal axon targeting in Drosophila. Cell 128, 961–975

16. Lee, H.H., Norris, A., Weiss, J.B., and Frasch, M. (2003) Jelly belly protein activates the receptor tyrosine kinase Alk to specify visceral muscle pioneers. Nature 425, 507–512

17. Liao, E.H., Hung, W., Abrams, B., and Zhen, M. (2004) An SCF-like ubiquitin ligase complex that con- trols presynaptic differentiation. Nature 430, 345–350

18. Bilsland, J.G., Wheeldon, A., Mead, A., Znamenskiy, P., Almond, S., Waters, K.A., Thakur, M., Beaumont, V., Bonnert, T.P., Heavens, R., Whiting, P., McAllister, G., and Munoz-Sanjuan, I. (2008) Behavioral and neurochemical alterations in mice defi- cient in anaplastic lymphoma kinase suggest therapeut- ic potential for psychiatric indications. Neuropsychopharmacology 33, 685–700

19. Orthofer, M., Valsesia, A., Ma¨gi, R., Wang, Q.P., Kaczanowska, J., Kozieradzki, I., Leopoldi, A., Cikes, D., Zopf, L.M., Tretiakov, E.O., Demetz, E., Hilbe, R., Boehm, A., Ticevic, M., No~ukas, M., Jais, A., Spirk, K., Clark, T., Amann, S., Lepamets, M., Neumayr, C., Arnold, C., Dou, Z., Kuhn, V., Novatchkova, M., Cronin, S.J.F., Tietge, U.J.F., Mu¨ller, S., Pospisilik, J.A., Nagy, V., Hui, C.C., Lazovic, J., Esterbauer, H., Hagelkruys, A., Tancevski, I., Kiefer, F.W., Harkany, T., Haubensak, W., Neely, G.G., Metspalu, A., Hager, J., Gheldof, N., and Penninger, J.M. (2020) Identification of ALK in thin- ness. Cell 181, 1246–1262.e1222

20. Sakamoto, K. and Kadomatsu, K. (2012) Midkine in the pathology of cancer, neural disease, and inflamma- tion. Pathol. Int. 62, 445–455

21. Stoica, G.E., Kuo, A., Powers, C., Bowden, E.T., Sale, E.B., Riegel, A.T., and Wellstein, A. (2002) Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase (ALK) and acts as a growth factor for different cell types. J. Biol. Chem. 277, 35990–35998

22. Stoica, G.E., Kuo, A., Aigner, A., Sunitha, I., Souttou, B., Malerczyk, C., Caughey, D.J., Wen, D., Karavanov, A., Riegel, A.T., and Wellstein, A. (2001) Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin. J. Biol. Chem. 276, 16772–16779

23. Mathivet, T., Mazot, P., and Vigny, M. (2007) In con- trast to agonist monoclonal antibodies, both C-terminal truncated form and full length form of Pleiotrophin failed to activate vertebrate ALK (ana- plastic lymphoma kinase)? Cell Signal. 19, 2434–2443

24. Moog-Lutz, C., Degoutin, J., Gouzi, J.Y., Frobert, Y., Brunet-de Carvalho, N., Bureau, J., Cre´minon, C., and Vigny, M. (2005) Activation and inhibition of anaplas- tic lymphoma kinase receptor tyrosine kinase by mono- clonal antibodies and absence of agonist activity of pleiotrophin. J. Biol. Chem. 280, 26039–26048

25. Murray, P.B., Lax, I., Reshetnyak, A., Ligon, G.F., Lillquist, J.S., Natoli, E.J., Shi, X., Folta-Stogniew, E., Gunel, M., Alvarado, D., and Schlessinger, J. (2015) Heparin is an activating ligand of the orphan receptor tyrosine kinase ALK. Sci. Signal. 8, ra6

26. Kadomatsu, K. and Sakamoto, K. (2014) Mechanisms of axon regeneration and its inhibition: roles of sul- fated glycans. Arch. Biochem. Biophys. 558, 36–41

27. Kadomatsu, K. and Sakamoto, K. (2014) Sulfated gly- cans in network rewiring and plasticity after neuronal injuries. Neurosci. Res. 78, 50–54

28. Sakamoto, K., Ozaki, T., Ko, Y.C., Tsai, C.F., Gong, Y., Morozumi, M., Ishikawa, Y., Uchimura, K., Nadanaka, S., Kitagawa, H., Zulueta, M.M.L., Bandaru, A., Tamura, J.I., Hung, S.C., and Kadomatsu, K. (2019) Glycan sulfation patterns define autophagy flux at axon tip via PTPRsigma-cortactin axis. Nat. Chem. Biol. 15, 699–709

29. Aricescu, A.R., McKinnell, I.W., Halfter, W., and Stoker, A.W. (2002) Heparan sulfate proteoglycans are ligands for receptor protein tyrosine phosphatase sigma. Mol. Cell. Biol. 22, 1881–1892

30. Shen, Y., Tenney, A.P., Busch, S.A., Horn, K.P., Cuascut, F.X., Liu, K., He, Z., Silver, J., and Flanagan, J.G. (2009) PTPsigma is a receptor for chon- droitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural re- generation. Science 326, 592–596

31. Coles, C.H., Shen, Y., Tenney, A.P., Siebold, C., Sutton, G.C., Lu, W., Gallagher, J.T., Jones, E.Y., Flanagan, J.G., and Aricescu, A.R. (2011) Proteoglycan-specific molecular switch for RPTPr clustering and neuronal extension. Science 332, 484–488

32. Tran, A.P., Warren, P.M., and Silver, J. (2020) Regulation of autophagy by inhibitory CSPG interac- tions with receptor PTPr and its impact on plasticity and regeneration after spinal cord injury. Exp. Neurol. 328, 113276

33. Huang, H. (2018) Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) receptor tyrosine kinase: a catalytic receptor with many faces. Int. J. Mol. Sci. 19, 3448.

34. Souttou, B., Carvalho, N.B., Raulais, D., and Vigny, M. (2001) Activation of anaplastic lymphoma kinase receptor tyrosine kinase induces neuronal differenti- ation through the mitogen-activated protein kinase pathway. J. Biol. Chem. 276, 9526–9531

35. Trowbridge, J.M. and Gallo, R.L. (2002) Dermatan sulfate: new functions from an old glycosaminoglycan. Glycobiology 12, 117R–125R

36. Du¨ndar, M., Mu¨ller, T., Zhang, Q., Pan, J., Steinmann, B., Vodopiutz, J., Gruber, R., Sonoda, T., Krabichler, B., Utermann, G., Baenziger, J.U., Zhang, L., and Janecke, A.R. (2009) Loss of dermatan-4-sulfotransferase 1 func- tion results in adducted thumb-clubfoot syndrome. Am. J. Hum. Genet. 85, 873–882

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