鶏卵漿尿膜培養が、肺腺癌での血管新生におけるTIPARP (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-inducible poly (ADP-ribose) polymerase) の役割を解明した。

概要

Kobe University Repository : Kernel
PDF issue: 2024-05-02

Chorioallantoic membrane assay revealed the
role of TIPARP (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin-inducible poly (ADP-ribose) polymerase)
in lung adenocarcinoma-induced angiogenesis

三浦, 賢仁
(Degree)
博士（医学）

(Date of Degree)
2023-03-25

(Resource Type)
doctoral thesis

(Report Number)
甲第8692号

(URL)
https://hdl.handle.net/20.500.14094/0100485876
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（課程博士関係）

学位論文の内容要旨

Chorioallantoic membrane assay revealed the role of
TIPARP (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-inducible poly (ADPribose)polymerase)in lung adenocarcinoma-induced angiogenesis

鶏 卵 漿 尿 膜 培 養 が 、 肺 腺 癌 で の 血 管 新 生 に お け る TIPARP (2,3,7,8 tetrachlorodibenzo -p-dioxin-inducible poly (ADP -ribose) polymerase)
の役割を解明した。

神戸大学大学院医学研究科医科学専攻
呼吸器外科学
（指導教員：眞庭
三浦

謙昌
賢仁

教授）

背景
分子標的薬や免疫チェックポイント阻害薬の登場により、非小細胞肺癌の治療は大きく変
化し、治療標的が腫瘍細胞にのみならず、腫瘍微小環境まで広がっている。しかし、現時点
ではこれらの薬剤の効果は一部の患者に限定され、薬剤の治療効果を投与前に予測すること
は困難である。この問題を解決すべく、患者由来の肺癌オルガノイドの樹立や患者由来癌細
胞異種移植マウスモデルを用いた薬剤スクリーニング法が報告されているが、前者では正常
細胞が混入し樹立が困難であること、後者では樹立に約 4 ヶ月間を要すること、などの難点
がある。そこで我々は、鶏卵の生育過程で生じる漿尿膜(CAM)上で行う CAM 培養に注目し
た。CAM はヒトの胎盤と同等の役割を担い、免疫系が幼弱であるため移植が成立しやすいと
報告されているが、肺癌の浸潤や血管新生について述べたものは少ない。本研究で我々は、
CAM 培養が肺癌の浸潤や血管新生の評価や薬剤感受性試験が行えるかを検討した。

肺癌の血管新生を研究するモデルとしての CAM 培養
CAM は、胚発生日（EDD）10 日から 15 日 にかけて急速に発達するため既報と同様に EDD10
に移植し 5 日培養を行なった。我々は以前、組織学的に患者の肺癌組織と同様の特徴を有す
るオルガノイドを肺癌細胞株から作製することに成功しており、移植片としてこれを用い
た。結果、12 試験中 10 試験（83％）で CAM への生着が確認された。さらに CAM 上の移植片
表面には、蛇行・拡張した新生血管が形成されることが確認できた。
免疫組織化学(IHC)を用いニワトリの血管とヒト細胞株由来オルガノイドの相互作用を検討
した。血管のマーカーとして Desmin を、ヒトのオルガノイドとニワトリの組織を区別する
マーカーとして哺乳類のみに発現する Amino acid transporter type 2 (ASCT2)を使用し
た。これらに対する免疫染色により、オルガノイドは CAM に浸潤し、血管に囲まれることが
分かった。移植前オルガノイドでは、ヒトの血管内皮を認識する CD31 抗体陽性の細胞が含
まれていたが、CAM 上のオルガノイドにはヒト CD31 陽性細胞は含まれていなかったことか
ら、移植したオルガノイドは、ニワトリの血管を誘導し生着していることが示唆された。以
上より CAM 培養が肺癌の浸潤および血管誘導の研究に適応可能であると考えられた。

A549-OKS 細胞の CAM 培養における血管新生能と浸潤能
我々は、ヒト肺癌細胞株（A549）に OCT3/4、KLF4、SOX2 をレトロウイルスベクターで導入
することで作製した細胞（A549-OKS）が A549-GFP 細胞と比較して高い浸潤能と血管内皮細
胞の維持能を in vitro で示すことを報告している。今回、これらの細胞の特性の違いが CAM
上で再現できるかを検討した。A549-GFP、A549-OKS の CAM 移植の成功率はそれぞれ 50%およ
び 66.6%であった。A549-GFP 細胞の移植片は、直線状の血管を誘導したが、A549-OKS 細胞の
移植片の周囲の血管はねじれ、蛇行していた。これらの血管の血流を TOKU Capillaro を用
い光学的に拡大して観察したところ、血管内の赤血球の動きや腫瘤からの流出・流入する血
流を可視化できた。A549-OKS 細胞は、蛇行した血管で覆われた白い塊を形成しており、周囲

の血管は不規則な血流を示し、毛細血管網を形成し、移植片から排出された赤血球が再び毛
細血管網を通って移植片に流れてくることが確認できた。また、組織学的検討により、
A549-OKS 細胞を移植した場合のみ、移植片の浸潤と移植片周辺の間質の浮腫が確認された。
免疫組織化学では、A549-GFP 細胞の移植では、ASCT2 陽性の移植片は浸潤せず CAM の上のみ
に見られ、Desmin 陽性の血管が主に移植片の近傍に観察されたのに対し、A549-OKS 細胞は
CAM に浸潤し、Desmin 陽性の血管で覆われていた。これらの結果は、A549-OKS 細胞が増殖と
浸潤のためにニワトリの血管を誘導していることを示していると考えられた。

CAM 上の血管新生能の定量化
画像解析ソフトウエア Imgage J を用い、CAM 上での血管新生能と腫瘍面積を定量化する系
の確立に取り組んだ。EDD10 にオルガノイドを CAM に移植し、血管新生を抑制することが既
知である Bevacizumab または対照としてリン酸緩衝液を浸したろ紙を EDD12 に置き、EDD14
に血管の面積と腫瘍の面積を測定した。その結果、Bevacizumab 投与による新生血管の面積
と腫瘍の面積の減少を定量的に示すことが出来た。

A549-TIPARP 細胞は CAM で血管新生を誘導した
我々は、A549-OKS で発現が上昇している血管関連遺伝子として過去に報告したものの中か
ら、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-inducible poly (ADP-ribose) polymerase
(TIPARP)に注目し、血管新生に関与しているかについて CAM 培養を用いた系で検討した。
TIPARP を導入した A549 細胞（A549-TIPARP）を作製し CAM に移植したところ、A549-TIPARP
細胞の周囲には移植片に収束する新生血管を認めた。血管面積と腫瘤面積を定量化したとこ
ろ、A549-TIPARP 細胞を移植した場合、どちらも A549-GFP 細胞と比較し有意に増加すること
を確認した。血流解析では、A549-TIPARP 細胞の移植片は、A549-OKS 細胞を移植した場合と
同様に、血管で覆われ、動静脈と毛細血管のネットワーク形成が観察された。また、IHC で
も、A549-TIPARP 細胞は多くの Desmin 陽性血管を誘導していることが確認された。これらの
結果により、TIPARP が血管新生に重要な因子であることが示された。

TIPARP は、細胞外マトリックスのリモデリングに関連する遺伝子を増強する
次世代シークエンサーを用い、A549-TIPARP 細胞と対照の A549-GFP 細胞の遺伝子発現プロ
ファイルを比較した。A549-TIPARP 細胞において、2 倍以上の発現上昇がみられた遺伝子 202
個と発現低下がみられた遺伝子 57 個を同定した。発現上昇した遺伝子群について pathway
解析を行ったところ、12 個の有意な pathway が同定された。これらのうち、7 つは細胞外マ
トリックスに関連し、4 つは細胞外マトリックスの分解とリモデリングに関連していた。一
方、発現低下した 57 個の遺伝子について pathway 解析を行ったところ、炎症性サイトカイ
ン関連 pathway を含む 18 個の有意な pathway が確認された。これらの結果から、TIPARP
は、細胞外マトリックスのリモデリングを介し血管新生を促進する可能性が示唆された。

考察
本研究では、CAM 培養が肺癌の取り巻く生着、浸潤、血管新生の複雑さを高倍率で捉え、
個々の毛細血管を観察できる培養法であることが示された。これまでも CAM 上の血管の密度
の定性的な評価は報告されているが、血管新生の動的な可視化と静的な定量化を報告したの
は本研究が初めてとなる。また、これまでの報告ではヒトの血管を含む患者由来の腎臓癌や
Glioblastoma を移植すると、ヒト由来の血管が生き残り、ニワトリの血管とつながることを
示したものがあるが、生体内のがん転移の場合、移動するがん細胞は血管を含んでおらず、
転移病巣の血管新生は腫瘍微小環境からの血管細胞の誘導に依存しているため、本システム
は、患者由来の組織移植試験と比較して、より生体内の転移病変の血管新生を反映し得るも
のと考えられる。本培養系において VEGF 阻害剤が肺癌の血管新生を特異的に阻害すること
が確認されたことは、新規選択的血管新生阻害剤の探索に応用できる可能性が示唆する。
癌における TIPARP の発現については、卵巣癌で TIPARP の高発現が予後不良や浸潤と関連
していることが報告されている一方で、大腸癌や乳癌では、TIPARP の高発現は予後良好と関
連することが報告されている。データベース（human protein atlas: http:
www.proteiatlas.org）によると、肺癌の 5 年生存率は TIPARP の高発現例では 38％、低発現
例では 47％である（P = 0.036 ）。今回の報告では、TIPARP の高発現が細胞外マトリックス
の分解・リモデリングを介して血管新生を誘導している可能性を初めて示した。
これまでの細胞外マトリックスと血管新生に関連する実験は単一の個別分子に着目したも
のが多い。CAM はフィブロネクチン、ラミニン、IV 型コラーゲン等複数の細胞外マトリック
スを含んでいるため、より生体に近い環境であると考えられる。TIPARP の血管新生への作用
は CAM のように複数の細胞外マトリックスを有する条件下でなければ明らかにできなかった
可能性が考えられる。CAM 培養は、腫瘍量に加え細胞外マトリックスのリモデリングを介し
て誘発される腫瘍血管新生とそれを標的とする候補薬剤を評価できる実験プラットフォーム
となることが期待される。

神 戸大学大学院医学（
系）
研究科（博士課程）

論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨

諭文題目

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甲第

3294 号

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受付番号

三浦 賢 仁

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鶏 卵 漿 尿 膜 培 養 が 、肺 腺 癌 で の 血 管 新 生 に お け る

TIPARP(
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) の役割を解明した。

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（要旨は 1
, 000字∼ 2, 000字程度
）

〔目的〕
肺癌の周囲組織との相互作用に関しては不明な点が多い。相互作用を観察するモデルとして異種移植
マウスモデルがあるが、樹立率が低く、樹立までに時間を要するなど問題がある。そこで、本研究では
A
M
)上で行う培養に注目した。この培養は免疫系統が幼弱であるた
鶏卵の発育過程で生じる漿膜尿膜（ C

め移植が成立しやすく、短期間で血管新生や浸潤を評価できる方法として用いられているが、肺癌に関
する報告は少ない。本研究では、 CAM培養が肺癌の浸潤や血管新生の評価や薬剤感受性試験が行えるか
を検討した。

〔方法ならびに成績〕
肺癌の血邸新生を研究するモデルとしての CAM竺養
既報と同様のプロトコールを作成した。移植片は固研究室より報告されている、肺癌細胞株から樹立
した組織学的に患者の肺癌組織と同様の特徴を有するオルガノイドを用いた。結果、 83％で CAMへの生
椅が確認された。
免疫組織化学 (IHC)を用いニワトリの血管とヒト細胞株由来オルガノイドの相互作用を検討した。オル
ガノイドは CAMに浸濶し、血管に囲まれていた。この血管がヒト由来か CAM由来かを探るべく検討を行
った。移植前オルガノイドでは、ヒトの血管内皮を認識する CD31抗体陽性の細胞が含まれていたが、
CAM上のオルガノイドには C
D
3
1陽性細胞は含まれておらず、 CAMの血管を標識する Desmi
nのみ陽性で

あったことから、移植したオルガノイドは、 CAMの血管を誘導し生着していることが示唆された。以上
より CAM培養が肺癌の浸潤および血管誘導の研究に適応可能であると考えられた。

A549-0KS細胞の CAM培養における卯管新生能と浸潤能

i
troでの細胞の特性の違いが CAM上で再現できるかを検討した。 A549-0KSは浸潤能と血管新
次 に inv
生能が高い細胞である．これを移植したところ A549細胞の移植片は、直線状の血管を誘導したが、
A549-0KS細胞の移植片の周囲の血管はねじれ、蛇行していた。これらの血管の血流を光学的に拡大して

観察したところ、血管内の赤血球の動きや腫瘤からの流出・流入する血流を可視化できた。 A549-0KS
細胞は、蛇行した血管で覆われ、周囲の血管は不規則な血流を示し、血管網を形成した。また、組織学
的検討により、 A549-0KS細胞を移植した場合、移植片の浸潤と周辺の間質の肥厚が確認された。免疫組
n陽性の血管で覆われていた。これらの結果は、
織化学では、 A549-0KS細胞は CAMに浸潤し、 Desmi
A549-0KS細胞が CAMの血管を誘導し浸潤していることを示している。

CAM上の血管新生能の定最化

画像解祈ソフトウエア Img
ageJを用い、 CAM上での血管新生能と腫瘍面積を定量化する系の確立に取
zumabを浸したろ紙を EDD12に置き、 EDD14に血管の面積と腫瘍の面積を測定した。
り組んだ。 Bevaci
zumab投与による新生血管の面積と腫瘍の面積の減少を定最的に示すことが出来た。
その結果、 Bevaci

A549-TIPARP細胞は C
A
l
1で血管新生を誘導した

次に血管新生に関わる可能性がありこれまで肺癌に関連した報告のない
2
,3
,7
,8-t
et
rachlorodi
benzo-p-di
oxi
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ly (
A
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P
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b
o
s
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) po
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merase (
T
I
P
A
R
P
)に注目し
CAM培養を用い検討した。 TIPARPを強制発現した A549-TIPARPを作製し CAMに移植したところ、周囲に

は血管網を認めた。血流解析では、 A549-TIPARP細胞は、 A549-0KS細胞を移植した場合と同様に、血管
網が観察された。また、 IHCでも、 A549-TIPARP細胞は多くの Desmi
n陽性血管を誘導していることが確
認された。これらの結果により、 TIPARPが血管新生に重要な因子であることが示された。

TIPARPは、紐胞外マトリックスのリモデリングに閲連する遥伝子を増強する

次世代シークエンサーを用い、 A549-TIPARP細胞と対照の A549細胞の遣伝子発現プロファイルを比較
した。 A549-TIPARP細胞で、 2倍以上の発現上昇がみられた造伝子 202個と発現低下がみられた迪伝子
57個を同定した。発現上昇した迪伝子群についてpat
hway解析を行ったところ、 1
2個の有意なpat
hway

が同定された。これらのうち、 7つは細胞外マトリックスに関連し、 4つは細胞外マトリックスの分解
とリモデリングに関連していた。これらの結果から、 TIPARPは、細胞外マトリックスのリモデリングを
介し血管新生を促進する可能性が示唆された。
〔総括〕
本研究では、 CAM培養が肺癌の取り巻く生着、浸潤、血管新生の複雑さを高倍率で捉え、個々の血管を
観察できる培養法であることが示された。本システムは、患者由来の組織移植試験と比較して、より生
体内の転移病変の血管新生を反映し得るものと考えられる。また、肺癌において TIPARPの高発現が細
胞外マトリックスの分解・リモデリングを介して血管新生を誘導している可能性を初めて示したもので
ある。

本研究は、肺癌の研究プラットフォームとしての CAM培養について研究したものであるが、従来行わ
れていなかった詳細な組織学的な評価や血流解析に加え、肺癌における TIPARPの高発現が細胞外マト
リックスのリモデリングを介して血管新生が誘発されることを初めて明らかにした報告である。 CAM培
養は、腫瘍の周囲の相互作用に関連した薬剤を評価できる実験プラットフォームとなりえることを示し
た点で価値ある業績と認める。よって、本研究者は、博士（医学）の学位を得る資格があると認める。