論文の公開元へ遷延性術後痛の分子生物学的機序の解明に関する研究
概要
博士論文
1
2
3
4
5
6
7
8
遷延性術後痛の分子生物学的機序の
9
解明に関する研究
10
11
12
13
14
15
16
東北大学大学院医学系研究科医科学専攻
17
外科病態学講座麻酔科学・周術期医学分野
鈴木
18
1
潤
1
＜略語一覧＞
2
ATF3; activating transcription factor 3
3
ARRIVE; Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments
4
CCI; chronic constriction injury
5
CPSP; chronic postsurgical pain
6
CR1-4; compliment receptor 1-4
7
CRPS; complex regional pain syndrome
8
DEG; differential expression gene
9
DRG; dorsal root ganglion
10
NMDA; N-Methyl-D-aspartic acid
11
GO: gene ontology
12
PSL; partial sciatic nerve ligation
13
RNA-Seq; ribonucleic acid sequencing
14
SC; spinal cord
15
SDH; spinal dorsal horn
16
SMIR; skin/muscle incision and retraction
17
SNL; spinal nerve ligation
18
SNS; sciatic nerve stretching
2
1
目次
2
[1] 要約・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4
3
[2] 研究背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・6
4
[3] 研究目的・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
5
[4] 研究方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・11
6
[5] 研究結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・19
7
[6] 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・23
8
[7] 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31
9
[8] 図表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・32
10
[9] 謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・46
11
[10] 文献・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・47
3
1
[1] 要約
2
【背景】術後 3 ヶ月以上続く創部や関連領域の痛みを遷延性術後痛（chronic
3
postsurgical pain: CPSP）という．多くの臨床研究の結果，CPSP の頻度が高
4
いことや，疫学的なリスク因子が判ってきた．一方で，CPSP の分子生物学的
5
な機序は依然不明である．その最も大きな理由は，CPSP の病態を再現したモ
6
デル動物が存在しないことである．本研究で，私は新規術後疼痛モデルラット
7
を開発し，このラットの CPSP モデル動物としての妥当性を検証した．さらに
8
ゲノム網羅的な遺伝子発現解析を行うことで CPSP の分子生物学的な機序を明
9
らかにすることを試みた．
10
【方法】雄性 Sprague-Dawley ラットを用いた．メスで大腿部の皮膚と筋層を
11
切開し，開創器で術野を 60 分間展開した．その際に，坐骨神経が長軸方向に
12
間接的に伸展されることから，この手術およびラットを sciatic nerve stretching
13
(SNS) 手術および SNS ラットと名付けた．機械刺激および熱刺激に対する
14
SNS ラットの逃避閾値の評価を術後 63 日目まで行った．また，術後 14 日目
15
に，SNS ラットを灌流固定し，坐骨神経と脊髄後根神経節 (dorsal root
16
ganglia: DRG)，脊髄 (spinal cord: SC) を摘出して Klüver-Barrera (KB) 染色
17
または免疫組織化学染色を行った．また，術後 14 日目に SNS ラットの DRG
18
と SC から全量 RNA（ribonucleic acid）を抽出して，それぞれの組織のトラン
4
1
スクリプトーム解析を行った．さらに，パスウェイ解析によって SNS ラットの
2
痛覚過敏に関連する可能性のあるパスウェイの候補を同定した．
3
【結果】SNS ラットは術後 49 日間持続する機械性痛覚過敏と 10 日間持続する
4
熱性痛覚過敏を示した．SNS ラットの術後 14 日目の坐骨神経の KB 染色で
5
は，広範な髄性変化が観察された．また，患側の DRG では ATF3 (activating
6
transcription factor 3) の発現がみられ，患側の SC では後角および前角でリン
7
酸化 NMDA 受容体が増加していた．術後 14 日目の DRG では 481 個，SC で
8
は 28 個の遺伝子発現変動（differential expression of gene: DEG）が同定され
9
た．パスウェイ解析では，SNS ラットの病態に関連する上位の biological
10
pathway のうち，phagosome formation と complement system の 2 つが DRG
11
と SC で共通して活性化していた．
12
【考察】これまでに報告された慢性疼痛モデル動物に対して，SNS ラットは，
13
臨床に即した器械や手技によって作成されている点，作成が容易で再現率が高
14
い点，そして神経障害性疼痛の特徴を示している点で優れていると考えられ
15
た．坐骨神経の脱髄性神経障害は痛覚過敏の原因の１つであると考えられた．
16
DRG での ATF3 の発現や SC でのリン酸化 NMDA 受容体の増加は、既存の神
17
経障害性疼痛モデルの特徴とも矛盾しない結果であった．一方で，DRG と SC
18
における DEG も，既存の慢性疼痛モデルの遺伝子発現プロファイルと一部共
5
1
通するものがみられた．以上から，SNS ラットは新規の CPSP モデルとして妥
2
当であると私は結論づけた．パスウェイ解析で同定された 2 つのパスウェイ
3
は，食細胞の活性化を介した神経系と免疫系のクロストークが CPSP の分子生
4
物学的な機序に関与していることを示唆している．
6
1
[2] 研究背景
2
術後 3 か月以上持続する，手術部位やその関連領域の痛みを遷延性術後痛
3
（chronic postsurgical pain: CPSP）という．2019 年に約 30 年ぶりに改訂され
4
た国際疾病分類 ICD-11 において，CPSP は初めて病名として収載された 1)．
5
手術や外傷後に，慢性的な創部の痛みで苦しむ患者が多いことは古くから医療
6
者に認識されてきたが，1998 年に Crombie ら 2)が，ペインクリニックを受診
7
した患者のうち，約 40 %は手術や外傷後の慢性疼痛が原因であったと報告し
8
たことから，この病態が一躍注目を集めることになった．21 世紀になり，具体
9
的にその発症率や疫学的なリスク因子などを求める研究が行われるようになっ
10
た． 近年行われた大規模な観察研究の結果でも，CPSP の発症率は術後 6 か月
11
の時点で約 40%，術後 12 か月の時点で約 35%と高いことや，そのうち重度の
12
痛みが残存している患者が約 2%いることが明らかになった 3)4)．また，長時間
13
手術や高侵襲手術のみならず，鼠経ヘルニアや乳房切除術などの体表面の短時
14
間手術であっても，それぞれ 20～50 %，5～35 %と少なくない頻度で発症する
15
こと，そして手術に起因する神経障害が重要なリスク因子であることなどが分
16
かってきた 1)4)5)．
17
一方で，CPSP の発症機序は未だに明らかになっていない．その最も大きな
18
理由は，CPSP の病態を再現したモデル動物が存在しないことである．歴史的
7
1
に実験動物を用いた痛みの研究は 1990 年代頃から盛んに行われるようにな
2
り，主にラットやマウスなどのげっ歯類を用いて行われてきた．様々な手術や
3
処置が考案され，それに合わせて疼痛を評価するための多様な行動実験手法も
4
開発されてきた 6)．足底切開手術や開胸手術による術後疼痛モデル 7)8)，坐骨神
5
経や脊髄神経の一部を結紮や切離する神経障害性疼痛モデル 9-12)，化学物質を
6
皮下に注入することで炎症を惹起する炎症性疼痛モデル 13)などが開発され，術
7
後急性疼痛や神経障害性疼痛のメカニズムと，それらを促進または抑制するメ
8
ディエーターの存在が明らかになってきた 6)14)．しかしながら，CPSP の病態
9
を再現した理想的な動物モデルはこれまでのところ存在しない．
10
これまでの研究から，げっ歯類を用いて CPSP モデルを作成する際に問題と
11
なる点は以下の 3 点である：(1) ヒトと比較してげっ歯類では一般に疼痛罹患
12
期間が短い，(2) 慢性疼痛モデルを作成するためには神経を意図的に結紮や切
13
離，圧挫するなど実臨床における手術手技からは乖離した処置が必要である，
14
(3) 慢性疼痛モデルは手術難易度が高いものが多く，成功率や再現率が低い．
15
Brennan ら 7)の足底切開手術による創部の痛覚過敏は僅か 3-5 日程度しか持続
16
せず，Buvanendran8)らの開胸手術は僅か 50 %の成功率と再現性が低い．
17
Chung ら 9)の脊髄神経結紮（spinal nerve ligation, SNL）モデルは長期間持続す
18
る痛覚過敏を惹起するが，手術難易度が高いことが問題とされる．Bennett ら
8
1
の 11)絞扼性神経損傷（chronic constriction injury, CCI）モデルや Seltzer ら 12)
2
の坐骨神経部分損傷（partial sciatic nerve ligation, PSL）モデルは，手術手技
3
は容易であるが，絞扼の程度や結紮部位が個体ごとに異なってしまうため，再
4
現性が低いという問題があった．また，これらの疼痛モデルでは神経自体を意
5
図的に結紮・切離するなど非臨床的な処置を行う必要があった．2008 年，
6
Flatters15)はラットの後肢の皮膚と筋肉をメスで切開し，開創器で牽引すること
7
で，足底の痛覚過敏が約 3 週間持続する SMIR（skin/muscle incision and
8
retraction）手術を報告した．SMIR 手術による術後疼痛モデルを CPSP モデル
9
として利用した研究 16)17)は散見されるが，われわれの経験上，SMIR 手術によ
10
る痛覚過敏は軽度であり，また痛覚過敏の発症率や再現率は低かった．CPSP
11
患者に特徴的な熱痛覚過敏などの神経障害性疼痛の要素を認めないという問題
12
もあった 15)18)．私は，繰り返しラットの SMIR 手術を行う中で，開創器を一層
13
深い筋層にかけることにより，間接的に坐骨神経が牽引され，その結果，足底
14
に長期間に渡る強烈な痛覚過敏を発症することに気づき，この手術を SNS
15
（sciatic nerve stretching）手術と名付けた．本研究では，SNS 手術による術後
16
疼痛モデルが CPSP モデルとして妥当であるかどうかを，行動実験，病理組織
17
学，そして末梢神経と中枢神経系における遺伝子発現プロファイルによって検
18
討することとした．
9
1
また，近年，マイクロアレイ法や RNA-Seq（ribonucleic acid sequencing）
2
による網羅的な遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）が様々な疾患の
3
病態解明に応用されている 19)．この新しい分子生物学的アプローチは，これま
4
での手法では困難であった自己免疫疾患のような複雑な病態においても，バイ
5
オマーカーや治療のターゲットとなる新規分子の発見を可能にしてきた 20)．ト
6
ランスクリプトーム解析は疼痛医学の研究にも応用されている．一次求心性神
7
経の細胞体の集合である脊髄後根神経節（dorsal root ganglion, DRG）や二次
8
求心性神経の存在する脊髄後角（spinal dorsal horn, SDH）における RNA-Seq
9
によって，術後急性疼痛や神経障害性疼痛をはじめ，複合性局所疼痛症候群
10
（complex regional pain syndrome, CRPS）のような特殊な慢性疼痛疾患の病態
11
をも解明する試みが最近報告されている 21-23)．特に，パスウェイ解析は複雑な
12
疾患の根底にある遺伝子や生物学的メカニズムの強力な解析手法であり，
13
CPSP のような慢性疼痛のメカニズムを網羅的に解析するのに最適の手法であ
14
ると私は考えた 24)．本研究では，SNS ラットの DRG と脊髄におけるパスウェ
15
イ解析によって，CPSP の分子生物学的な機序を明らかにすることを試みた．
10
1
[3] 研究目的
2
SNS 手術により新規術後疼痛モデルラットを作成し，行動実験と病理組織学
3
的検討および遺伝子発現プロファイルから CPSP モデルとしての妥当性を検討
4
することを目的とした．また，その術後疼痛モデルラットの DRG 及び脊髄に
5
おけるトランスクリプトーム解析を行うことで，CPSP の分子生物学的機序の
6
一端を明らかにすることを目的とした．
11
1
[4] 研究方法
2
1) 実験動物
すべての実験は，東北大学における実験動物等に関する規定（動物実験承認
3
4
番号#2017MdA-238），および国際疼痛学会による動物実験倫理ガイドライン
5
25)
に沿って計画・実行し，ARRIVE ガイドライン 26)に従って報告した．
6
実験に使用したラットは日本エスエルシー株式会社より購入し，おがくずを
7
敷いたプラスティック製のケージ（36 cm × 33 cm × 20 cm）内に 3 匹 1 組で飼
8
育された．室温 23 ℃下に自由に飲水と経口摂取可能な環境で飼育され，照明
9
により 12 時間毎の明暗環境が整えられた．合計 34 匹のラットを実験に用い
10
た．
11
12
13
2) SMIR 手術を改良した SNS 手術による新規 CPSP モデルラットの作成
6 週齢の雄性 Sprague-Dawley ラット（190-210 g）を用いて SNS 手術によ
14
る術後疼痛モデルを作成した．全ての手術は同一の術者が行った．イソフルラ
15
ン 2 %による麻酔下に，ラットを背臥位として右大腿から下腿の剃毛を行った
16
後に，70 %エタノール液で術野の消毒を行った．Flatters の SMIR 手術 15)と同
17
様に，伏在静脈の約 4 mm 内側で後肢の長軸方向に 1.5-2 cm の皮膚切開を置
18
き，薄筋を露出させた．引き続き，伏在静脈の約 4 mm 内側で薄筋を長軸方向
12
1
に 7-10 mm 程度切開して内側広筋を露出した．SMIR 手術では内側広筋は切開
2
しないが，その後，さらに内側広筋を長軸方向に 7-10 mm 程度の切開し，ペ
3
アン鉗子で切開部を鈍的に展開した後に開創器を挿入した．切開した内側広筋
4
の下に坐骨神経が同定できるが，神経には直接触れないように注意しながら，
5
大内転筋の筋腹と切開した薄筋・内側広筋に 4 本の鋭鈎がかかるように開創器
6
(Cat.# 13-1090, Biomedical Research Instruments Inc., Silver Spring, MD)を挿
7
入し，2 cm 幅に広げて，皮膚・筋層および坐骨神経を長軸方向に 60 分間牽引
8
した（図 1）．牽引している間，創部は生理食塩液で浸した滅菌ガーゼで被覆
9
し，ラットの体全体をドレープで覆った上で加温式手術台を用いて体温の低下
10
を防止した．イソフルラン濃度はラットの呼吸回数が 40-60 回/分となるよう
11
に 1-2 %で調整した．60 分間牽引した後，筋層と皮膚を 5-0 PDS® II と 4-0 ナ
12
イロンでそれぞれ縫合して閉創した．
13
sham 手術では皮膚と薄筋，内側広筋の切開は上記と同様の手順で行ったが，
14
開創器による牽引は行わずに，60 分後に同様に閉創した．
15
3) 行動実験
16
すべてのラットは行動実験の 3 日前から毎日 1 時間ずつ実験装置内に置か
17
れ，実験装置と環境に馴化させた．置換ブロック法を用いた無作為化により，
18
ラットは SNS 手術群（n=10）と sham 手術群（n=10）に振り分けられた．ま
13
1
た，行動実験において，検者はラットがどちらの手術を受けたか分からないよ
2
うに盲検化された．
3
なお，以下の行動実験における逃避行動は，素早く脚を退ける，足を舐め
4
る，または足を振り回すなどの行動として定義し，麻痺などによって痛み刺激
5
を回避できないような状況ではないことを確認した上で行った．術後 14 日目
6
までの体重を測定した．
7
また，SNS 手術群で術後 14 日間の間に痛覚過敏がみられなかった個体は，
8
以降の解析からは除外した．
9
3-1) von Frey 試験
10
ラットが自由に歩き回ることができるように金属製のワイヤーがメッシュ状
11
に敷かれたプラスティック製ケージ内（21 cm × 13 cm × 14 cm）で，機械刺
12
激に対する逃避閾値を測定するために von Frey 試験を行った（図 2A）．0.4 g
13
から 26 g までの 10 種類の von Frey フィラメントを up-down 法 27)の規則に従
14
ってラットの後肢の足底にゆっくりと押し当てて，機械刺激による逃避閾値を
15
測定した．測定は手術の直前，術後 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63
16
日後に両側の後肢の足底で行った．各日の測定の前には装置と環境へ馴化させ
17
るために 30 分間の時間を設け，左右の測定は 5 分間以上の間隔を空けて行っ
18
た．また，組織の損傷を防ぐために，刺激強度は 26 g を上限とし，26 g の刺
14
1
激で逃避行動がみられない場合は 26 g を閾値として記録した．0.02 g 以下の強
2
さで逃避行動が出現する場合は，疼痛が著しいと判断し，直ちに実験を中止し
3
てイソフルランの過剰投与による安楽死を行うこととした．
4
3-2) Hargreaves 試験
5
ラットが自由に歩き回ることができるようにガラス製の板が敷かれたプラス
6
ティック製ケージ内で，熱刺激に対する逃避閾値を測定するために Hargreaves
7
試験 28)を行った（図 2B）．輻射熱刺激装置（Model 390; IITC/Life Sciences
8
Instruments, Woodland Hills, CA）を用いてラットの足底に一定の強度の熱刺
9
激を加え，逃避するまでの時間を測定した．予め無処置のラットを用いて，逃
10
避閾値が 10-12 秒になるように熱刺激強度を調整した上で測定を行った．測定
11
は手術の直前，術後 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 日後に両側の後
12
肢の足底で， 5 分以上の間隔を空けて合計 5 回行われ，最大値および最小値を
13
除いた 3 回の平均値を逃避閾値とした．また，組織の損傷を防ぐために，刺激
14
時間の上限は 20 秒とし，20 秒間の刺激で逃避行動がみられなかった場合は 20
15
秒を閾値として記録した．熱刺激で 3 秒以内に逃避行動が出現する場合は，疼
16
痛が著しいと判断し，直ちに実験を中止してイソフルランの過剰投与による安
17
楽死を行うこととした．
18
15
1
4) 組織学的評価
2
坐骨神経の損傷の部位と程度を評価するために，術後 14 日目に坐骨神経の
3
Klüver-Barrera (KB)染色と脊髄後根神経節（dorsal root ganglia: DRG）の免疫
4
組織化学染色を行った．また，脊髄における NMDA（N-Methyl-D-aspartic
5
acid）受容体の NR2B サブユニットのチロシンリン酸化部位（NR2B Tyr-
6
1472）のリン酸化を調べるために，同様に術後 14 日目に脊髄の免疫組織化学
7
染色を行った．
8
4-1) KB 染色
9
術後 14 日目に SNS 手術群（n=4）および sham 手術群（n=4）のラットを
10
イソフルランによる麻酔下に 0.1M リン酸緩衝 4%ホルムアルデヒド液で灌流
11
固定し，坐骨神経を摘出した後に短軸断面の切片を作成し，腓腹神経分岐部
12
（proximal），総腓骨神経分岐部（central），脛骨神経（distal）の 3 箇所につい
13
て KB 染色を行った．顕微鏡は BZ-9000 microscope (KEYENCE Japan, Tokyo,
14
Japan) を用い，対応するソフトウェア（BZ-H2A, ver. ...
この論文で使われている画像
