A nitrogen-containing bisphosphonate inhibits osteoblast attachment and impairs bone healing in bone-compatible scaffold

概要

1．序論
ビスフォスフォネート製剤（以下BP製剤）は固形がんの骨転移や多発性骨髄腫，高カルシウム血症や骨粗鬆症の治療薬として広く使用されているが，薬剤関連顎骨壊死（Medication-related osteonecrosis of the jaw；以下MRONJ）を引き起こす代表的な薬剤である．MRONJは顎骨の露出，腫脹，疼痛，排膿，知覚神経障害，軟組織壊死や口腔内外の瘻孔を主な症状とし，BP製剤によるMRONJの発生頻度は注射薬で0.2-6.7%，経口薬で0.028-0.4％と報告され(Solomon et al., 2013; Ruggiero et al., 2014)，発症すると患者のQOLを著しく低下させる．発症機序は未だ明らかでないが，抜歯などの外科侵襲後に発症することが多いことから，骨の治癒に何らかの原因があるのではないかと考えられている．現在使用されるBP製剤はハイドロキシアパタイト（以下HA）への吸着力が増強された窒素含有剤であり，吸着することで破骨細胞に取り込まれてその活動を抑制する．一方で骨の治癒過程において活動する骨芽細胞はHAに接着することで作用を発現していくが，BP製剤が骨芽細胞の細胞接着に与える影響は不明な点が多い．HA薄膜コーティングによって強力な骨芽細胞誘導能・骨治癒促進能を付与したチタンファイバー製スキャホールドが近年考案された(Hirota et al., 2010, 2011, 2016)．本研究ではこのHA薄膜にBP製剤を吸着されることによって及ぼされる骨芽細胞の接着，機能発現および骨治癒への影響を検討した．

2．実験材料と方法
直径50μmのチタンファイバーからなる空隙率87％のチタンファイバースキャホールドを用いた直径15mmおよび5mm，厚さはいずれも1.5mmのディスクを実験基材とした．EDTA-Ca錯体のアルコール溶液とメタリン酸ジブチルアンモニウム塩をCa/P=1.67の割合で調整した分子プレカーサー溶液に基材を浸漬させ，600℃に加熱することでスキャホールドをHAでコーティングし，初代窒素含有BP製剤のパミドロネート溶液にHAコーティングスキャホールドを一晩浸漬させ，パミドロネートを吸着させたスキャホールドを作製し，これを用いた実験群をBP吸着群とした．パミドロネートを吸着させていない対照群をBP非吸着群とした．パミドロネートの濃度は0.001Mと0.01Mを作製し（0.001M-BP吸着群，0.01M-BP吸着群），X線を用いた表面分析により窒素含有BP製剤がスキャホールドにコーティングされていることを確認した．invitroでは0.001M-BP吸着群を，in vivoでは0.001M-BP吸着群と0.01M-BP吸着群を使用した．

正常ヒト骨芽細胞を直径15mmのスキャホールドに播種し，4時間と24時間培養後にチタンファイバーに接着している生細胞数と細胞の大きさを計測し，0.001M-BP吸着群とBP非吸着群の2群で比較した．生細胞数はCell Counting Kit-8を用いて，細胞の大きさは蛍光顕微鏡によって観察して計測した．また同様に7日および14日間培養し，アリザリンレッドにて石灰化産物を染色し，その程度を比較した．続いて，ラット頭蓋骨に直径5.2mmの骨欠損を形成し，直径5mmのスキャホールドを埋入した．スキャホールドはBP非吸着群，0.001M-BP吸着群，0.01M-BP吸着群を用い，3週，6週，9週後にスキャホールド内の骨組織形成の程度を評価した．BP吸着群とBP非吸着群の比較には，マン・ホイットニーのU検定を用い，p＜0.05で有意差ありとした．

3．結果
正常ヒト骨芽細胞のチタンファイバーへの接着は播種4時間後，24時間後ともにBP吸着群はBP非吸着群に比べ有意に生細胞数が少なく，細胞の長径も有意に小さかった．骨芽細胞の石灰化試験においては7日目，14日目ともにBP吸着群では有意に石灰化産物が少なかった．ラット頭蓋骨を用いた骨形成能の評価では埋入3週間後，6週間後ではBPの濃度に関わりなくBP吸着群はBP非吸着群に比べ有意に骨形成が少なかった．9週では両群に有意差はなかったが，0.001M-BP吸着群の骨形成率はBP非吸着群と同程度であった．

4．考察
パミドロネートがチタンファイバー上のHAと結合する事で骨芽細胞とHAの接着を阻害し，その後の細胞の成熟や機能発現まで障害されることでスキャホールド内の骨治癒が阻害されたと考えられた．外科侵襲を受けた骨組織は通常，骨芽細胞の働きにより骨が形成され治癒する．しかしBP製剤により骨芽細胞がHAに接着することができず，骨治癒は阻害され，不完全な治癒となり感染または骨壊死を引き起こし，MRONJを発症すると考えられた．MRONJの発症はBP製剤が結合した骨組織において骨のリモデリングが阻害される事に加え，骨硬化による骨髄の減少や感染，粘膜の免疫異常など複数の要因が挙げられているが，本研究ではリモデリングに関わる骨芽細胞の接着不良，それに続く骨形成不全が窒素含有BP製剤により起こり得ることが明らかにされた．

5．結語
窒素含有BP製剤による骨芽細胞とHAの接着阻害はMRONJ発症要因の1つになり得ると考えられた．

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