浮遊HEK293細胞を用いた遺伝子治療用アデノ随伴ウイルスの生産性及び品質の向上に関する研究

概要

論文要約
浮遊 HEK293 細胞を用いた遺伝子治療用アデノ随伴ウイルスの
生産性及び品質の向上に関する研究
理工情報生命学術院 生命地球科学研究群 生命産業科学学位プログラム
椎名

俊介

遺伝子治療は、高い治療効果とその効果の持続性から、次世代のバイオ医薬品としての期
待は高く、世界中で臨床試験中の開発品は増加傾向であり、2022 年 10 月時点までに世界で、
in vivo 遺伝子治療、ex vivo 遺伝子治療、それぞれ 12 種類（条件付承認、条件期限付承認およ
び販売終了を含む）の製品が承認されている（国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子医薬部ホ
ームページ）。遺伝子治療は、治療用の遺伝子をベクター等を用いて患者の細胞に投与する
“in vivo 遺伝子治療”と、治療用の遺伝子を導入した細胞を患者に投与する“ex vivo 遺伝子
治療”に分けられる。現在、in vivo 遺伝子治療で用いられるベクターの 70％以上は、ウイル
スベクターであると言われているが（Alhakamy et al. 2021）、その中でも遺伝子組み換えアデ
ノ随伴ウイルス（recombinant Adeno-Associated Virus: rAAV）は、1）導入される遺伝子が患者
のゲノムに組み込まれない、2）長期間に渡り患者の細胞内に留まり目的のタンパク質を発現
する、3）免疫原性や、ヒトに対する病原性が低い、等の優れた特長があり、臨床試験が行わ
れているウイルスベクターの約半数が rAAV である（Rooij et al. 2019; Li et al. 2020; Alhakamy
et al. 2021; Mendell et al. 2021; Zhao et al. 2021）。
rAAV の生産では、rAAV ベクターの生産に必要な 3 種類のプラスミド DNA を HEK293 細
胞などの哺乳類細胞に transfection して、一過的に発現させる方法が広く使用されている。こ
の方法は、(a) 生産細胞に細胞毒性を示す rAAV 由来タンパク質の発現と細胞の増殖を分けて
おこなうことができる、(b) 治療用タンパク質の遺伝子を変えるだけで同様の生産手法を取る
ことができる、等の利点がある。しかしながら、細胞濃度が高密度な条件下では transfection
効率が低下し、生産性が低下する等の課題もある（Chahal et al. 2014; Robert et al. 2017; Rooij
et al. 2019）。さらに、HEK293 細胞で生産される rAAV 粒子のうち、内部に治療用の遺伝子
を組み込んだ rAAV のゲノムを含むものは 5〜30%程度と言われており、治療用遺伝子を持た
ない rAAV 粒子との分離は精製工程での大きな負荷となっている（Joiner et al. 2022）。
遺伝子治療用ウイルスベクターの需要や用途の拡大を考えた場合、上述したプロセスの生
産効率が低いために、投与量の多い疾患に対する需要に応えることができない（Dobrowsky et
al. 2021）。そのため、生産性を向上できる技術開発が強く求められている。
本研究では、工業的生産プロセスにおいてスケールアップ性の高い、浮遊化された HEK293
細胞培養系で、① rAAV2 型（rAAV2）の生産性の向上、② 内部に断片化されていない rAAV2
ゲノムを含む rAAV2 粒子の割合を向上させるプロセス条件の探索と応用、について検討をお
こなった。さらに、rAAV2 の生産性が向上した条件下において、生産細胞内で生じている現
象を、細胞内プロテオミクスに基づいた Pathway 解析をおこない、rAAV2 の生産時に必要な
Pathway 制御を特定し、ウイルスベクターの工業的生産プロセスでの応用に繋げることを試
みた。
遺伝子治療用のウイルベクターや哺乳類由来細胞を用いた医薬品用タンパク質の生産にお
いては、目的タンパク質の生産時にエンハンサーとなる物質を培養液中に添加することで、
生産性を向上させる手法が知られている（Davie, 2003; Backliwal et al. 2008; Otsuki et al. 2008;
Cervera et al. 2015）。本研究では、エンハンサーの選定をおこなう中で、Histone deacetylase
(HDAC) インヒビターとして働くことで、タンパク質生産性の向上への効果が広く知られて
いるバルプロ酸（Backliwal et al. 2008; Otsuki et al. 2008）を添加する際に、溶剤として用いた

エタノールに、rAAV2 生産時の細胞の生存率維持効果や rAAV2 生産性の向上効果があるこ
とを発見した。また、エタノールの添加は、rAAV2 粒子内にパッケージングされた rAAV2 ゲ
ノムの断片化が抑制されることや、生産した rAAV2 の細胞感染効率が向上するなど、遺伝子
治療用のウイルスベクターとして重要な、感染した細胞での治療用遺伝子の発現に関連する
品質の向上効果があることを見出した。エタノールの最適な添加濃度について種々検討した
結果、0.56％(v/v)が rAAV2 の生産には最適な濃度として設定された。
エタノールの添加と、rAAV2 の生産性や品質向上の関連性を生産細胞の Pathway の変化か
ら調べるため、rAAV2 生産時にエタノールを添加した条件と無添加の条件（コントロール）
について、細胞内のプロテオミクスに基づく pathway 解析を実施した。その結果、rAAV2 生
産時にエタノールを添加することにより、Necroptosis signaling pathway や Interferon signaling
など、細胞死や免疫反応に関する pathway の活性が低下し、NAD signaling pathway や Protein
kinas A signaling のような細胞内のシグナル伝達や遺伝子発現が向上する pathway が活性化し
ている事が明らかとなった。また、これらの pathway の変化に関係するタンパク質を特定し
た。
遺伝子治療に用いられる rAAV には、rAAV2 の他にも血清型の異なる種類が知られている
が（Nakai, 2009）、エタノールの添加による、rAAV2 の生産性や、品質向上の効果は、rAAV2
以外の血清型でも同様の効果がみられた。
エタノールの添加による rAAV2 の生産性や品質向上の検討に加え、rAAV2 生産中の制
御パラメータについても検討をおこなった。Chinese hamster ovary 細胞を用いた、抗体や、遺
伝子組換えタンパク質の生産では、培養の途中で培養温度をシフトさせることで、生産細胞
の増殖を抑えながら目的タンパク質の生産性を向上させる手法が広く用いられている（Moore
et al. 1997; Kaufmann et al. 1999; Yoon et al. 2003）。また、HEK293 細胞においても、組換えタ
ンパク質の生産時に培養温度をシフトさせると生産性が向上することが報告されている（Lin
et al. 2015）。しかしながら、HEK293 細胞での rAAV 生産時の培養温度と、生産性や品質の
関連はこれまで報告されていなかった。そこで、HEK293 細胞の浮遊培養において、rAAV2 生
産時の培養温度シフトが rAAV2 の生産性や品質に及ぼす影響を解析した。種々検討した結
果、rAAV2 生産時の培養温度を適切にシフトさせると、生産細胞内への rAAV2 の生産量が向
上する事が明らかとなった。さらに、培養温度のシフトとエタノールの添加を併用すること
により、rAAV2 の生産性が向上すると共に、rAAV2 粒子内にパッケージングされた rAAV2
ゲノムの断片化の抑制も認められた。また、rAAV2 粒子内に rAAV2 ゲノムを含む割合も向上
した。遺伝子治療用のベクターとして、細胞への感染性は重要な品質指標となるが、得られ
た rAAV2 は、コントロール条件で生産した rAAV2 と比べて同等以上の細胞感染性があり、
rAAV2 生産時の培養温度のシフトとエタノール添加の有効性が示された。更に、バイオリア
クターを用いて同様の検討を種々おこなった結果、フラスコを用いた試験と同様な rAAV2 の
生産性と、rAAV2 ゲノムを含むカプシドの割合向上効果が見られた。
本研究で独自に見出した、エタノールの添加と培養温度のシフトは、安価で、安全な手法
のため使いやすく、安定的な結果も得られることから、今後、ウイルスベクターの工業的生
産のみならず、細胞を用いた様々なバイオ医薬品の生産などへの幅広い応用も期待できる。

引用文献
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