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超低頻度な体細胞点突然変異定量法の新規開発とがん化学療法による正常血液細胞への変異蓄積の証明

上田, 翔 筑波大学 DOI:10.15068/0002008054

2023.09.04

概要

筑 波

大

学

博士（医学）学位論文

超低頻度な体細胞点突然変異定量法の
新規開発とがん化学療法による
正常血液細胞への 変異蓄積の証明

2022
筑波大学大学院博士課程人間総合科学研究科
上田

翔

1

原典論文の再利用 (Re-use)について

この学位論文は、以下を原典とする。また、原典論文の内容を、National
Academy of Sciences の規定に従って再利用している。

A quantification method of somatic mutations in normal tissues and their
accumulation in pediatric patients with chemotherapy. Sho Ueda, Satoshi Yamashita,
Miho Nakajima, Tadashi Kumamoto, Chitose Ogawa, Yu-yu Liu, Harumi Yamada, Emi
Kubo, Naoko Hattori, Hideyuki Takeshima, Mika Wakabayashi, Naoko Iida, Yuichi
Shiraishi, Masayuki Noguchi, Yukio Sato, Toshikazu Ushijima. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 119(31):e2123241119,
2022. doi: 10.1073/pnas.2123241119

2

目次
第 1 章. 背景. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
1.1. 正常組織における発がんの素地. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
1.2. 化学療法による二次発がんリスクの増加と正常な血液細胞に与える
影響. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
1.3. 正常組織の低頻度な体細胞変異定量の問題点. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
1.4. 低頻度な体細胞変異定量のための既存の検体採取法とシークエンシ
ング法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
第 2 章. 目的. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
第 3 章. 方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
3.1. 細胞株検体および臨床検体の収集と DNA 精製. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
3.2. 人為的に作成した低頻度変異を有するモデル DNA. . . . . . . . . . . . . . . .12
3.3. 変異原で処理した 293FT 細胞株. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
3.4. Duplex-loop アダプターの合成. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
3.5. 末梢血検体の骨髄球とリンパ球の分離. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
3.6. EcoSeq ライブラリの作成とシークエンシング. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
3.7. DCS 作成のためのデータ処理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
3.8. DCS による変異コールのためのデータ処理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
第 4 章. 結果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
4.1. BamHI 制限酵素とサイズ選択による解析ゲノム領域の縮小. . . . . . . .18
4.2. 人為的に作成した低頻度変異の検出に成功. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
4.3. モデル DNA 検体で背景細胞に存在する真の変異の確認. . . . . . . . . . .21
4.4. 変異原によって誘導された低頻度変異の検出に成功. . . . . . . . . . . . . . .22
4.5. 化学療法によって小児患者の血液細胞に蓄積した変異の証明. . . . . 22
第 5 章. 考察. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

3

5.1. EcoSeq の特徴と利点. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
5.2. EcoSeq による未曝露正常組織の変異頻度の推定. . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
5.3. 正常組織に蓄積した体細胞変異が反映する過去の曝露歴. . . . . . . . . .25
5.4. EcoSeq 解析の最適化. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
5.5. 化学療法による正常血液細胞への体細胞変異蓄積と二次発がんへの
影響. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
5.6. 研究の limitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
第 6 章. 結語. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
第 7 章. 図表. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Figure 1 - 13. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Table 1 - 9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
第 8 章. 要約図. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
第 9 章. 謝辞. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54
第 10 章. 参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55

4

第 1 章. 背景

1.1. 正常組織における発がんの素地
ヒト正常組織には加齢や様々な環境要因（喫煙、アルコール摂取、化学療法、
放射線治療など）への曝露の結果、腫瘍のない「正常な」組織にもジェネティッ
クないしはエピジェネティックな異常が蓄積し、将来の発がんと関連している
と考えられている (1, 2)。実際に、ステージ I 肺癌患者の二次性の異時性多発肺
癌リスクは 4-7 倍と高く、一次肺癌発症後から 10 年以上経過してもそのリスク
は減らないことが報告されており (3)、正常組織にも発がんに繋がる何らかの異
常がすでに蓄積していることを裏付けている 。このような「発がんの素地
(Cancerization field)」を構成するジェネティックないしはエピジェネティックな
異常の蓄積を正確に定量することが可能になれば、将来の発がんリスクの推定
に有用と考えられ、予防医療の観点から臨床的にも重要である (4-13)。
一般的に、ジェネティックな異常としては、点突然変異や挿入欠失変異、コ
ピー数多型、遺伝子再構成などがあり、エピジェネティックな異常としては、
DNA メチル化やヒストン修飾などが挙げられ、腫瘍において広く解析が行われ
ている。正常組織においても、例えば喫煙者の気管支粘膜はドライバー変異を有
する細胞割合が増加することが報告されている (12)。また、胃粘膜の DNA メチ
ル化は加齢やピロリ菌感染に伴う慢性炎症によって蓄積し、胃粘膜の高メチル
化は胃癌発症リスクと関連していることが明らかになっている (14-16)。このよ
うに正常組織に蓄積したジェネティック・エピジェネティックな異常は発がん
の素地の解明に重要であるが、特に体細胞変異のようなジェネティックな異常
は、腫瘍組織の解析と比較して検体サンプリング方法やシークエンシング方法
の技術的な困難さから依然として解析の報告は少ない。

5

1.2. 化学療法による二次発がんリスクの増加と正常な血液細胞に与える影響
正常組織に蓄積したジェネティックやエピジェネティックな異常は、治療
に関連した二次発がんにも影響を及ぼすと予想される。例えば化学療法や放射
線療法による治療を受けた小児がん患者は、将来的に 3-6 倍の治療関連の二次発
がんリスクがあることが知られている (17, 18)。特にプラチナ製剤やアルキル化
製剤、トポイソメラーゼ II 阻害薬などの化学療法は、将来的な治療関連の二次
性骨髄性腫瘍リスクと関連していることが明らかになっており (19-23)、このよ
うな二次性がん発症前の正常な血液細胞にも化学療法の影響を受けてすでに体
細胞変異の蓄積が起こっていることが予想されていたものの、証明されてはい
なかった。
正常な造血幹細胞に蓄積した体細胞変異の量が将来の二次発がん発症リス
クと関連していると仮定すると、造血幹細胞のサロゲートとして末梢血液細胞
に蓄積した体細胞変異を解析することで、化学療法後の採血フォローアップに
よる簡便な二次発がんリスクの評価や、より変異蓄積の起きにくい薬剤の選択
および新規開発に繋がることが期待される。
また、点突然変異の変異パターンを変異塩基 6 種類 (C>A, C>G, C>T, T>A,
T>C, T>G)とその前後の塩基の組み合わせで 96 パターンに分類した変異スペク
トラムは、腫瘍の過去の変異原曝露に特異的な分布（変異シグネチャ）の組み合
わせで構成されていることが知られている (24, 25)。そのため、正常組織に蓄積
した体細胞変異を検出し、変異スペクトラムとスペクトラムを構成する変異シ
グネチャを解析すれば、蓄積した変異の由来が明らかになる。例えば化学療法後
の正常血液細胞の解析の結果、投与された薬剤に関連した変異シグネチャを認
めれば、検出された変異が確かに化学療法によって誘導された証拠となる。さら
に、複数の薬剤を使用していた場合にはどの薬剤がより変異蓄積に影響を与え
たのかの推定にも有用と考えられる。

6

1.3. 正常組織の低頻度な体細胞変異定量の問題点
加齢や様々な環境要因への曝露によって生じる体細胞点突然変異は細胞の
クローナルな増殖（腫瘍性増殖）を促すドライバー変異の原因として重要だが、
クローナルな増殖に直接関与しないパッセンジャー変異はゲノム領域全体でド
ライバー変異の約 1 万倍存在すると報告されている (2, 26, 27)。正常組織に潜在
的に蓄積しているこれらパッセンジャー変異を中心とした無数の変異を正確に
定量し、その変異頻度や変異シグネチャを評価することは発がんの素地解明や
二次発がんリスク推定のために非常に意義があると考えられるが、通常のサン
プリング方法と次世代シークエンサーを用いた変異解析では困難である。
その理由として、モノクローナルな細胞集団である腫瘍と異なり、正常組織
はポリクローナルな組織であるため、特定の遺伝子領域に生じたパッセンジャ
ー変異は 1 細胞ないしは 1 幹細胞由来から増殖した小さなクローン集団（クロ
ーナルパッチ）にのみ存在している。よって、通常の変異解析では極端に低い変
異アレル頻度しか得ることができないため、検出された変異が真の変異なのか、
多種多様なエラー（ライブラリ作成時の PCR エラーやシークエンシング時の読
み取りエラーなど）なのか区別することが困難となる。また、通常のシークエン
シング方法では、DNA 二本鎖の片側鎖のみに生じた premutagenic lesion（二本鎖
に固定されておらず通常であれば DNA のミスマッチ修復機構によって修復さ
れるような塩基置換）も変異として検出してしまう問題がある。そのため、この
ような超低頻度な体細胞変異を検出するには、検体サンプリングや解析方法自
体の工夫が必要となる。

1.4. 低頻度な体細胞変異定量のための既存の検体採取法とシークエンシング法
正常組織に蓄積する体細胞点突然変異の頻度は過去のトランスジェニック

7

マウスを使用した研究で、106-108 bp に 1 変異程度と報告されてきた (28, 29)。
また、最近の研究では、ヒト正常組織に存在する小さなクローナルパッチを解析
に利用するために、1 検体を空間的に極小片に分割して採取したり (4, 8, 9, 11,
12)、単細胞培養ないしはオルガノイド化して別個に解析する手法が用いられて
いる (5, 10, 30)。これらの労力を要する検体サンプリングの工夫を行えば、同一
のクローナルパッチ由来細胞の検体全体に占める割合が可能な限り高くなり、
変異アレル頻度が次世代シークエンサーを用いた通常の変異解析で測定できる
レベルになる。
例えば、Martincorena らは食道上皮を複数の小さなクローナルパッチに分割
して個別に全ゲノムシークエンシングを行うことで、加齢により NOTCH1 や
TP53 などのドライバー遺伝子変異を有する細胞割合が正常食道上皮で増加する
ことを明らかにした (8)。また、吉田らは同様の方法で気管支上皮を解析するこ
とで、喫煙により正常気管支上皮に NOTCH1 や TP53、ARID2 などのドライバ
ー遺伝子変異を有する細胞が増加するが、肺癌に発現の多い FAT1、PTEN、
CHEK2、ARID1A などのドライバー遺伝子変異は必ずしも正常気管支では増加
しないことを示した (12)。Blokzijl らは、結腸、小腸、肝臓について様々な年齢
のクローナルなオルガノイドを作成して全ゲノムシークエンシングを行うこと
で加齢により体細胞変異の蓄積が起こることを証明した (5)。
一方で、通常の方法で採取し保存されている正常組織由来の DNA 検体を用
いて変異解析を行うためには、解析方法自体の工夫が必要であり、過去にはシー
クエンシングの正確性を上げる様々な手技が開発されている (6, 7, 13, 31-36)。
代表的なものとして、分子バーコードを DNA 断片に付加し 1 分子のみに存在す
る変異をエラーと区別する方法や、同様の方法を特定の遺伝子領域に限定して
行う方法、環状増幅法で増幅した DNA 断片を繰り返しシークエンシングするこ
とでエラーを除外する方法などが挙げられる (33)。その中で、Duplex sequencing

8

法は、DNA 二本鎖を分子バーコード付きのアダプターでタグ付けすることで、
DNA 二本鎖に固定した真の変異のみを高精度かつ高感度に検出し、PCR エラー
やシークエンシング時の読み取りエラーも除外することが可能である (31, 32)。
正常組織に蓄積した低頻度な体細胞変異も理論的には検出可能であるが、アダ
プターのライゲーション効率が低いことや、全ゲノム領域を Duplex sequencing
で解析するには PCR で増幅した同一のバーコードを有する複数のリードをシー
クエンシングすることが求められるため、1 検体あたりの解析に必要なリード数
が膨大になる問題点がある。
多数の検体を効率よく低コストで解析できることは、臨床的な応用への適
応拡大や広く解析方法を普及させる上で非常に重要である。NanoSeq は、制限酵
素により解析ゲノム領域を縮小させる reduced representation sequencing (37, 38)を
Duplex sequencing と組み合わせた方法で、シークエンシングリード数の削減に
成功しているが、それでも 1 検体あたり 300M paired-end リードという多数のリ
ード数が必要となる (13)。また、一塩基多型 (SNP)の除外のために追加のシー
クエンシングも必要であった。したがって、これまでは検体サンプリングの工夫
が不要な通常保存の DNA 検体を利用可能かつ低コストに低頻度な体細胞変異
が定量可能な解析方法は存在しなかった。

9

第 2 章. 目的

超低頻度な体細胞点突然変異を効率よく低コストで定量する解析方法を開
発する。正常な小児末梢血液細胞を造血幹細胞のサロゲートとして解析するこ
とで、化学療法が正常血液細胞への変異蓄積を増加させることを証明する。

10

第 3 章. 方法

3.1. 細胞株検体および臨床検体の収集と DNA 精製
正常組織の解析のためにヒト細胞株検体およびヒト末梢血検体を使用した。
ヒトリンパ芽球細胞株の TK6 は American Type Culture Collection (Manassas、 VA)
から入手した。ヒト不死化膵管上皮細胞株の HPDE-4/E6E7 は MS Tsao’s laboratory
から入手した。ヒト胎児腎細胞株の 293FT は Thermo Fisher Scientific (Waltham、
MA)から入手した。TK6 および HPDE-4 細胞のゲノム DNA はフェノール・クロ
ロホルム法で精製し、293FT 細胞のゲノム DNA は QIAamp DNA Mini Kit
(QIAGEN, Hilden, Germany)を使用して精製した。
末梢血検体は、国立がん研究センターバイオバンクに保管されていた小児
肉腫患者 26 患者の末梢血由来ゲノム DNA 26 検体と、新規に採血を行った上記
26 患者中の 6 患者から得られた 8 検体（2 患者は時期を分けて 2 回の追加採血
を行った）を使用した。これらの研究は、国立がん研究センターの研究倫理審査
委員会で審査を受け承認された（研究課題番号 2017-454 および 2018-024）。バイ
オバンク保管 DNA については FlexiGene DNA Kit (QIAGEN)を使用して精製され
た DNA を使用した。新規に採血を行った末梢血検体については、白血球を含む
血漿除去血から QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)を使用してゲノム DNA を精製
した。
全てのゲノム DNA は核酸濃度と二本鎖 DNA 濃度を測定した。核酸濃度は
NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific)を使用して、260 nm と 280 nm の吸光度
を測定することで計算された。二本鎖 DNA 濃度は Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA
Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)を使用して、二本鎖 DNA に Intercalation した
色素を測定することで計算された。

11

3.2. 人為的に作成した低頻度変異を有するモデル DNA
TK6 細胞株と HPDE-4 細胞株について、全ゲノムシークエンシングを行う
ことで両細胞株の SNP を検出した。シークエンスライブラリーは TruSeq DNA
PCR-Free kit (Illumina, San Diego, CA)を使用して作成し、NovaSeq 6000 (Illumina)
でシークエンシングを行った (300M paired-end リード/検体, 150-bp paired-end
sequencing)。 ...

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