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31

8. 図

図 １. LRRK1 は Parkin 依存的マイトファジーに必要である。

(A) LRRK1 ノックダウンの損傷ミトコンドリアの除去に対する効果を検討した。コントロ

ールまたは LRRK1 siRNA を処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin と siRNA 耐性野生

型 GFP-LRRK1(WTr)または kinase-negative 型 GFP-LRRK1(KMr)を記載の通りに発

現させた。CCCP(10μM)で 24 時間処理した細胞を、ミトコンドリアマトリクスタンパク

質 C-lll core 1 抗体(マゼンタ)と Flag 抗体(シアン)で染色した。白の点線は FlagParkin 発現細胞を示し、アスタリスクは Parkin が発現していない細胞を示す。スケー

ルバーの長さは 10μm である。 (B) ミトコンドリアの分解について定量化した。FlagParkin 発現細胞のうち、C-lll core 1（ミトコンドリア）のシグナルが完全に消失した細

胞の割合を計測した。各回 30 以上の細胞を解析し、３回の独立した実験を行った。

エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test に

より行った。 *** : P<0.001、n.s. : 有意差なし。

32

pRab7 mitochondria

localization(%)

図 ２. LRRK1 は損傷ミトコンドリア上の Rab7 Ser-72 のリン酸化に必要である。

(A,C) LRRK1 ノックダウンによるミトコンドリア上の Rab7 Ser-72 のリン酸化に対する

効果を検討した。コントロールまたは LRRK1 siRNA を処理した U2OS 細胞に FlagParkin または siRNA 耐性野生型 GFP-LRRK1(WTr)またが kinase-negative 型 GFPLRRK1(KMr)を発現させ、CCCP (10μM)で 3 時間処理した。その後、ミトコンドリアマ

ーカーTOM20 抗体（緑）、pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）、Flag 抗体（シアン）で染色し

た。白の点線は Parkin 発現細胞を示し、黄矢印は Parkin が局在したミトコンドリア上

の pS72-Rab7 を示す。スケールバーは 10μm である。（B,D） (A,C)の定量化を行っ

た。Parkin 発現細胞の内、pS72-Rab7 が TOM20 または Flag-Parkin（ミトコンドリア）

と共局在している細胞の割合を示した。各回（B）70 以上、（D）30 以上の細胞を解析

し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は

Dunnet’s multiple-comparison test により行った。*** : P<0.001、n.s. : 有意差なし。

33

図 3. LRRK1 は CCCP 処理によって活性化する

HEK293 細胞に Flag-Rab7 と野生型 Flag-LRRK1(WT)または kinase-negative 型

Flag-LRRK1(KM)を共発現させ、CCCP (10μM)で 3 時間処理した。これらの細胞の

溶解液を図に示した抗体を用いて western blot を行った。

34

図 4. LRRK1 は ULK の下流で CCCP 依存的な Rab7 Ser-72 のリン酸化に機能して

いる

(A,C) Rab7-Ser-72 のリン酸化に対する ULK1/ULK2 ダブルノックダウンの効果を検

討した。コントロール、ULK1/ULK2、または ULK1 と ULK2 siRNA を処理した U2OS 細

胞に Flag-Parkin と空ベクターまたは GFP-LRRK1(Y944F)を図に示すように発現させ

た。CCCP (10μM)で 3 時間処理後、TOM20 抗体(緑)、pS-72 Rab7 抗体（マゼンタ）、

Flag 抗体(シアン)で染色した。白の点線は Parkin 発現細胞を示し、黄矢印はミトコン

ドリア上の pS72-Rab7 を示す。また、白矢印は GFP-LRRK1(Y944F)が局在したエンド

35

ソームと思われる場所上の pS72-Rab7 を示す。スケールバーは 10μm である。

(B,D) (A,C)について定量化を行った。Parkin 発現細胞の内、pS72-Rab7 が TOM20 ま

たは Flag-Parkin（ミトコンドリア）に局在する細胞の割合を示した。各回 30 以上の細

胞を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検

定は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。** : P<0.01、*** : P<0.001、

n.s. : 有意差なし

36

GFP-LRRK1

HA-ULK1

IB: GFP

(kDa)

250

150

IB: HA

LRRK1

ULK1

IP: HA

IB: GFP

250

LRRK1

Total lysate

図 5. LRRK1 と ATG101、FIP200、ATG13 または ULK1 との結合

(A) HEK293 細胞に GFP-LRRK1 と Flag-ATG101、Flag-FIP200 または Flag-ATG13

を図に示すように共発現させた。LRRK1 との結合は、Flag 抗体を用いた免疫沈降

（IP）によって検出し、図に示す抗体を用いて western blot を行った。(B) HEK293 細

胞に GFP-LRRK1 と HA-ULK1 を図に示すように共発現させた。LRRK1 との結合は

HA 抗体を用いた免疫沈降（IP）によって検出し、図に示す抗体を用いて western blot

を行った。

37

図 6. CCCP 依存的な Rab7 Ser-72 のリン酸化に対する ATG101 ノックダウンの効果

(A) コントロールまたは ATG101 siRNA を処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin を発現

させた。これに CCCP (10μM)を 3 時間処理した後、TOM20 抗体（緑）、pS72-Rab7

抗体（マゼンタ）、Flag 抗体（シアン）を用いて染色した。白の点線は Parkin 発現細胞

を示し、黄矢印はミトコンドリアに局在する pS72-Rab7 を示す。スケールバーは 10μ

m である。(B) (A)の定量化を行った。Parkin 発現細胞の内、pS72-Rab7 が TOM20（ミ

トコンドリア）に局在している細胞の割合を示した。各回 30 以上の細胞を解析し、3 回

の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s

multiple-comparison test により行った。n.s. : 有意差なし。

38

図 7. CCCP 依存的な Rab7 Ser-72 のリン酸化に対する ATG13 ノックダウンの効果

(A) コントロールまたは ATG13 siRNA を処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin と GFPLRRK1(Y944F)を図に示すように発現させた。これに CCCP (10μM)を 3 時間処理し

た後、pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）、Flag 抗体（シアン）を用いて染色した。白の点線は

Parkin 発現細胞を示し、黄矢印は Parkin が局在するミトコンドリアと共局在する

pS72-Rab7 を示す。白矢印は GFP-LRRK1(Y944F)が局在するエンドソーム上の

pS72-Rab7 を示す。スケールバーは 10μm である。(B) (A)の定量化を行った。

Parkin 発現細胞の内、pS72-Rab7 が Flag-Parkin（ミトコンドリア）に局在している細胞

の割合を示した。各回 30 以上の細胞を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラー

39

バーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test により行

った。** : P<0.01、n.s. : 有意差なし。(C) タンパク質二量体誘導化合物を用いた、

LRRK1(Y944F)をミトコンドリアに強制的に局在させるシステムの概念図を示した。(D)

LRRK1(Y944F)をミトコンドリアに強制的に局在させた場合の、Rab7 Ser-72 のリン酸

化に対する効果を検討した。コントロールまたは ATG13 siRNA を処理した U2OS 細

胞に FKBP-GFP-LRRK1(Y944F)と FRB-Fis1 を発現させ、rapalog （0.5μM）で 24 時

間処理した。細胞は pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）と TOM 20 抗体（シアン）で染色し

た。白の点線は GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞を示し、黄矢印は GFP-LRRK1(Y944F)

が局在したミトコンドリア上の pS72-Rab7 を示している。スケールバーは 10μm であ

る。(E) (D)を定量化した。GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞の内、GFP-LRRK1(Y944F)が

局在するミトコンドリアと pS72-Rab7 が共局在している細胞の割合を示した。各回 30

以上の細胞を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、

有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。*** : P<0.001、n.s. :

有意差なし。

40

Rapalog

FKBP-GFPLRRK1 (Y944F)

pS72 Rab7

TOM20

Merge

図 8. FRB-Fis1 は FKBP-GFP-LRRK1(Y944F)のミトコンドリア局在に必要である

U2OS 細胞に FKBP-GFP-LRRK1(Y944F)を発現させ、rapalog (0.5μM)で 24 時間処

理した。細胞は pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）と TOM20 抗体（シアン）で染色した。白の

点線は GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞を示す。スケールバーは 10μm である。

41

図 9. LRRK1 は CCCP 依存的に ATG13 及び ULK1 と結合する。

(A) LRRK1 と ATG13 の CCCP 依存的な結合を検討した。HEK293 細胞に GFPLRRK1 を発現させ、CCCP (10μM)で 3 時間処理した。複合体形成は GFP 抗体を用

いた免疫沈降 (IP)によって検出し、図に示す抗体を用いて western blot を行った。

(B) LRRK1 と ULK1 の結合について検討した。HEK293 細胞に GFP-LRRK1 を発現さ

せ、CCCP (10μM)で 3 時間処理した。複合体形成は GFP 抗体を用いた免疫沈降に

よって検出し、図に示す抗体を用いて western blot を行った。

42

図 10. Rab7 Ser-72 リン酸化に対する ATG13 ミトコンドリア強制局在の効果

(A,C) FKBP-GFP-ATG13 と FRB-Fis1 を共発現させた細胞に、野生型 MycLRRK1(WT)または Myc-LRRK1(Y944F)の存在下 (C) または非存在下 (A) で

rapalog (0.5μM) を 24 時間処理した。細胞は pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）と TOM20

または Myc 抗体（シアン）を用いて、図に示すように染色した。黄矢印はミトコンドリア

に局在した pS72-Rab7 を示し、白矢印はミトコンドリアに局在した Myc-LRRK1(WT)の

シグナルを示す。スケールバーは 10μm である。(B,D) (A,C)を定量化した。GFPATG13 発現細胞の内、pS72-Rab7 がミトコンドリアに局在した細胞の割合を示した。

各回 30 以上の細胞を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差

を示し、有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。

*** : P<0.001、n.s. : 有意差なし。

43

図 11. ULK1 は in vitro で LRRK1 をリン酸化する

HEK293 細胞に GFP-LRRK1(KM)を発現させ、その溶解液から GFP 抗体を用いた免

疫沈降によって GFP-LRRK1(KM)タンパク質を精製した。精製した LRRK1 タンパク質

は、GST-ULK1 リコンビナントタンパク質と、 [g-32P] ATP の存在下で 30℃、20 分震

盪した。自己リン酸化された ULK1 とリン酸化された LRRK1 は SDS-PAGE で分離

し、総タンパク質量は Coomassie Brilliant Blue (CBB) 染色によって確認した。

44

図 12. ミトコンドリア分解に対する ATG101 ノックダウンの効果

(A) コントロールまたは ATG101siRNA を処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin を発現

させ、oligomycin (10μM)と antimycin A (10μM)を 3 時間共処理 (O/A) した。細胞

はミトコンドリアマトリクスマーカー C-lll core 1 抗体（緑）と Flag 抗体（マゼンタ）で染

色した。白の点線は Parkin 発現細胞を示す。スケールバーは 10μm である。(B) (A)

の定量化を行った。Flag-Parkin 発現細胞の内、ミトコンドリアマトリクスのシグナルが

消失した細胞の割合を表示した。各回 30 以上の細胞を解析し、３回の独立した実験

を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s multiplecomparison test により行った。 *** : P<0.001。

45

図 13. 損傷ミトコンドリア分解における LRRK1 と ULK1/2 の関係

(A) ULK1/ULK2 ダブルノックダウンによる損傷ミトコンドリアの分解に対する効果を検

討した。コントロールまたは ULK1/ULK2 siRNA を処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin

と GFP-LRRK1(Y944F)を図に示すように発現させ、oligomycin (10μM)と antimycin A

(10μM)を 24 時間共処理 (O/A) した。細胞はミトコンドリアマトリクスマーカー C-lll

core 1 抗体（マゼンタ）と Flag 抗体（シアン）で染色した。白の点線は Parkin 発現細胞

を示す。スケールバーは 10μm である。(B) (A)の定量化を行った。Flag-Parkin 発現

細胞の内、ミトコンドリアマトリクスのシグナルが消失した細胞の割合を表示した。各

回 30 以上の細胞を解析し、３回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を

示し、有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。 *** :

P<0.001、n.s. : 有意差なし。

46

図 14. マイトファジーに対する LRRK1(Y944F)ミトコンドリア強制局在の効果

(A,C) LRRK1(Y944F)をミトコンドリアに強制的に局在させた場合の、ATG9 や LC3 の

ミトコンドリアへのリクルートに対する効果を検討した。U2OS 細胞に FKBP-GFPLRRK1(Y944F)と FRB-Fis1 を発現させ、Rapalog (0.5μM) で 24 時間処理した。細胞

は、(A) ATG9 抗体、(C) LC3 抗体(マゼンタ)と TOM20 抗体（シアン）で染色した。白の

点線は GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞を示し、黄矢印はミトコンドリアに局在した

ATG9 または LC3 のシグナルを示す。スケールバーは 10μm である。(B,D) (A,C)の

定量化を行った。GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞の内、ATG9 (B) または LC3 (D) が

TOM20 と共局在した細胞の割合を表示した。各回 30 以上の細胞を解析し、3 回の

独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s

47

multiple-comparison test により行った。 *** : P<0.001。(E) LRRK1(Y944F)をミトコン

ドリアに強制的に局在させた場合の、ミトコンドリアの分解に対する効果を検討した。

U2OS 細胞に FKBP-GFP-LRRK1(Y944F)と FRB-Fis1 を発現させ、Rapalog (0.5μM)

で 72 時間処理した。細胞はミトコンドリアマトリクスマーカーPDH E2/E3bp 抗体（マゼ

ンタ）で染色した。白の点線は GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞を示す。スケールバーは

10μm である。(F) (E)の定量化を行った。GFP-LRRK1(Y944F)発現細胞の内、ミトコン

ドリアマトリクスのシグナルが存在する細胞の割合を表示した。各回 30 以上の細胞

を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定

は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。 n.s. : 有意差なし。

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図 15. CCCP 依存的な Rab7 Ser-72 リン酸化における TBK1 と LRRK1 の関係

(A) TBK1 ノックダウンによる Rab7 Ser-72 のリン酸化に対する影響を検討した。コン

トロール、TBK1、LRRK1 siRNA を図に示すように処理した U2OS 細胞に Flag-Parkin

を発現させた。細胞は CCCP (10μM) で 3 時間処理した後、TOM20 抗体（緑）、

pS72-Rab7 抗体（マゼンタ）、Flag 抗体（シアン）で染色した。白の点線は Parkin 発現

細胞を示し、黄矢印はミトコンドリアに局在した pS72-Rab7 を示す。スケールバーは

10μm である。(B) (A)の定量化を行った。Parkin 発現細胞の内、pS72-Ran7 が

TOM20 と今日局在する細胞の割合を表示した。各回 30 以上の細胞を解析し、3 回

の独立した実験を行った。エラーバーは標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s

multiple-comparison test により行った。 *** : P<0.001、n.s. : 有意差なし。 (C)

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LRRK1(Y944F)をミトコンドリアに強制的に局在させた時の効果について検討した。コ

ントロールまたは TBK1 siRNA を処理した U2OS 細胞に FKBP-GFP-LRRK1(Y944F)

と FRB-Fis1 を共発現させ、rapalog (0.5μM) で 24 時間処理した。細胞は pS72Rab7 抗体（マゼンタ）と TOM20 抗体（シアン）で染色した。白の点線は GFPLRRK1(Y944F)を発現させた細胞を示し、黄矢印はミトコンドリアに局在した pS72Rab7 を示している。スケールバーは 10μm である。(D) (C)の定量化を行った。GFPLRRK1(Y944F)発現細胞の内、pS72-Rab7 と TOM20 が共局在する細胞の割合を表

示した。各回 30 以上の細胞を解析し、3 回の独立した実験を行った。エラーバーは

標準偏差を示し、有意差検定は Dunnet’s multiple-comparison test により行った。

*** : P<0.001、n.s. : 有意差なし。

50

mitochondria

damage

TBK1

ULK1/2

FIP

200

ATG13

LRRK1

ATG

101

S72

Rab7

ATG9A, LC3

recruitment

mitophagosome

formation

mitochondria

clearance

図 16. ULK 複合体-LRRK1 経路による Parkin 依存的マイトファジー制御機構

ULK 複合体は LRRK1 に依存的な経路と非依存的な経路を媒介している。ATG101

は後者の経路に属している。LRRK1 非依存的な経路は、LRRK1 依存的に誘導され

るマイトファゴソームの生合成の下流で LRRK1 依存的な経路と合流する。

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図 17. 各種 siRNA の効果

(A-E) Flag-Parkin を発現させた U2OS 細胞にコントロール、LRRK1 (A)、ULK1 (B)、

ATG101 (C)、ATG13 (D)、TBK1 siRNA (E) を処理した。これらの細胞の溶解液を、図

に示す抗体を用いて western blot を行った。Flag-Parkin はローディングコントロール

として用いた。

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