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Simple derivation of skeletal muscle from human pluripotent stem cells using temperature-sensitive Sendai virus vector

TAN, GHEE WAN 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23812

2022.03.23

概要

骨格筋（SkM）を含むさまざまな細胞型に分化する多能性を持つヒト多能性幹細胞、再生医療や病態モデリングに応用されている。我々は、ヒト胚性幹細胞（ESC）およびヒト人工多能性幹細胞（iPSC）から、SkM へ分化誘導するシンプルな方法の確立を目指した。分化誘導法として、SkM の発生に追いて重要な転写因子の一つである MyoD1）の一過性発現による、直接運命転換法を用いた。病態モデルを構築する際に、多検体の iPS 細胞から SkM へと効率よく分化誘導を行う必要があるため、分化誘導法は単純化されていることが重要となる。そのため、添加操作のみで遺伝子を導入することができるセンダイウイルス（SeV）ベクターを、MyoD1 の導入担体として用いた。この SeV ベクターは、感染後も細胞質内にとどまる RNA ウイルス由来であり、宿主ゲノムへのランダムな組み込みのリスクが低く、感染効率が高いことから、iPS 細胞の樹立や iPS 細胞からの分化誘導に汎用されてきたベクターである。さらに、遺伝子改変により 38℃以上の高温環境で細胞質内から除去される特性を持つ温度感受性 SeV を用いることとした。マウス Myod1 遺伝子のオープンリーディングフレームを含む配列を、SeV 特異的転写調節シグナル配列を含むかたちで、SeV /TS7ΔF ベクター配列内に挿入し、SeV18 + mMyoD1 /TS7ΔF（SeV-Myod1）を構築した。ヒト ESC の継代播種と同時、あるいは追加で 48 時間後に SeV-Myod1 に感染させたところ、分化開始 8日目時点における SkM 分化マーカーの myosin heavy chain（MHC）で定量評価した分化効率は、MOI = 64 かつ 0 日目と 2 日目の二回感染させることで、重大な細胞死が生じない範囲で最も高いことを明らかにした。

さらに、培養開始 3 日目から、SeV-Myod1 の熱感受性特性を利用し、38－40℃の環境における培養によりベクター除去を試みると、39－40℃では細胞死が強く生じることがわかった。一方で、38℃では細胞毒性は限定的で、なおかつ MHC陽性細胞の形態が紡錘状に変化し、より成熟した形態へと変化していることがわかった。さらに異なる温度帯で三胚葉それぞれへの分化傾向を検討したところ、38℃の培養環境は中胚葉系への分化誘導を加速させることも明らかにした。さらに、SkM への分化誘導を、SkM 関連マーカーの遺伝子発現パターンから確認した。また、38℃環境培養を経て SeV ベクターが除去されていることを、免疫蛍光抗体法と定量的 RT-PCR により確認することができた。

培養開始後 14 日目でも残存する多能性幹細胞を除去するために、多能性幹細胞特異的レクチンを指標として細胞毒性物質 PE38 を送達することで、効率的に多能性幹細胞を除去し、最終的に約 76％の確率で、ESCs から MHC 陽性 SkM を分化誘導することができた。

ESCs を用いて開発した SeV-Myod1 による SkM 分化誘導法を、iPSCs にも適応できることを確認するために、3 名の健常人由来 iPS 細胞それぞれにSeV-Myod1 添加・38℃熱処理・残存多能性幹細胞除去を行うことで、80%程度の効率で分化誘導させることができた。最後に誘導した SkM の機能を見るために、電気刺激に応答したカルシウム流入を観察すると、ESC および 3 名分の iPSC で同様に電気刺激応答性も観察された。

結論として、SeV ベクターを用いて、シンプルな SkM 誘導法が確立され、将来の疾患メカニズムの調査および創薬に有益であると考える。

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