論文の公開元へアミロイドーシスに対するサフランの効果:α-シヌクレインを標的としたパーキンソン病モデルに対する作用を中心に
概要
アミロイドーシスに対するサフランの効果：
α-シヌクレインを標的としたパーキンソン病モデル
に対する作用を中心に
2023年 1月
井上 栄二
アミロイドーシスに対するサフランの効果：
α-シヌクレインを標的としたパーキンソン病モデル
に対する作用を中心に
筑波大学大学院
理工情報生命学術院
生命地球科学研究群
生命農学学位プログラム
博士（生命農学）学位論文
井上
栄二
目次 ........................................................................ 1
略語 ........................................................................ 3
第 1 章 序章 ................................................................ 5
第 2 章 α-シヌクレイン（αS）凝集に対するサフランおよびその成分の作用（in vitro）
................................................................... 14
第 1 節 背景 ..................................................................14
第 2 節 材料・実験方法 ........................................................18
2.2.1 材料 .................................................................18
2.2.2 サフラン中のcrocin-1、crocin-2およびcrocetinの定量 ....................20
2.2.3 αS凝集体形成および凝集体解離に対する作用 .............................21
2.2.3.1
試料の調製 ................................................21
2.2.3.2
チオフラビンT蛍光法 .......................................21
2.2.3.3
透過電子顕微鏡（TEM） .....................................22
2.2.4 統計処理 .............................................................22
第 3 節 結果 ..................................................................23
2.3.1 サフラン中のcrocin-1、crocin-2およびcrocetinの定量 ....................23
2.3.2 αS凝集体形成および凝集体解離に対する作用 .............................25
第 4 節 考察 ..................................................................32
第 3 章 パーキンソン病モデルショウジョウバエにみられる病態表現型出現に対するサフラ
ンの作用（in vivo） ........................................................ 35
第 1 節 背景 ..................................................................35
第 2 節 材料・実験方法 ........................................................37
3.2.1 材料 .................................................................37
3.2.2 ショウジョウバエの系統、交配、維持 ....................................37
3.2.3 クライミング試験と寿命試験 ............................................39
3.2.4 ショウジョウバエ複眼イメージング ......................................39
3.2.5 細胞毒性試験..........................................................40
3.2.6 統計処理 .............................................................40
1
第 3 節 結果 ..................................................................42
3.3.1 A30PまたはG51D変異αS発現ショウジョウバエのクライミングに対する作用 ..42
3.3.2 A30PまたはG51D変異αS発現ショウジョウバエの寿命に対する作用 ..........46
3.3.3 A30P変異αS発現ショウジョウバエの複眼形態に対する作用 ................49
3.3.4 αS凝集体誘発SH-SY5Y細胞毒性に対する作用 .............................52
第 4 節 考察 ..................................................................54
第 4 章 種々のアミロイドタンパク質（αS、アミリン、タウ、アミロイドβおよびβ2-ミ
クログロブリン）凝集に対するサフランおよびその成分の作用（in vitro） ..... 59
第 1 節 背景 ..................................................................59
第 2 節 材料・実験方法 ........................................................63
4.2.1 材料 .................................................................63
4.2.2 種々のアミロイドタンパク質（αS、アミロイドβ、タウ（3R、4R）、アミリンおよ
びβ2-ミクログロブリン）凝集に対する作用 ..............................63
4.2.2.1
試料の調製 ................................................64
4.2.2.2
チオフラビンT蛍光法 .......................................65
4.2.3 統計処理 .............................................................66
第 3 節 結果 ..................................................................67
4.3.1 種々のアミロイドタンパク質（αS、アミリン、タウ（3R、4R）、アミロイドβおよ
びβ2ミクログロブリン）凝集体形成および凝集体解離に対する作用 .........67
第 4 節 考察 ..................................................................72
第 5 章
総括と今後の展望
................................................ 74
第 1 節 総括 ..................................................................74
第 2 節 今後の展望 ............................................................75
謝辞 ....................................................................... 83
参考文献 ................................................................... 85
2
略語
cpm
Cycles per minute（サイクル毎分）
D-MEM
Dulbecco's modified Eagle medium（ダルベッコ改変イーグル培地）
D-PBS
Dulbecco's phosphate-buffered saline（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩
水）
EC50
Half maximal effective concentration（50%有効濃度）
FBS
Fetal bovine serum（ウシ胎児血清）
HCl
Hydrochloric acid（塩酸）
HPLC
High performance liquid chromatography（高速液体クロマトグラフィー）
IC50
Half maximal inhibitory concentration （50%阻害濃度）
β2MG
β2-microglobulin（β2-ミクログロブリン）
MEM
Minimum essential medium（イーグル最少必須培地）
MTS
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルフォフェニル)-2H-テトラゾリウ
ム）
PD
Parkinson's disease（パーキンソン病）
QOL
Quality of life（生活の質）
ROS
Reactive oxygen species（活性酸素種）
SE
Standard error（標準誤差）
3
SEM
Scanning electron microscope（走査電子顕微鏡）
αS
α-Synuclein（α-シヌクレイン）
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethane（トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン）
UAS
Upstream activating sequence（上流活性化配列）
TEM
Transmission electron microscope（透過電子顕微鏡）
4
第 1 章 序章
20世紀から21世紀にかけて薬学は大きく進歩し、かつては治すことが難しかっ
た疾患の多くを薬で治せるようになった。例えば、1928年アレクサンダー・フレ
ミングにより発見された世界初の抗生物質ペニシリンは、かつてはなすすべもな
く命を落とした細菌感染症を劇的に改善させた。一方で、未だ薬をはじめとした
治療方法が十分でない疾患は現在でも数多く存在する。公益財団法人ヒューマン
サイエンス振興財団では主要60疾患の薬剤貢献度と治療満足度を軸に、具体的に
どの疾患の治療方法が十分でないのか調査し、公表している（Fig. 1）。
5
Fig. 1 主要60疾患の治療満足度および薬剤貢献度. ヒューマンサイエンス振興財
団（2020）より引用
6
この図において治療満足度の低い疾患は、未だ十分な治療方法が存在しないこ
とを表している。著者はこれらの疾患の中から、薬剤貢献度が65%と高く、多く
の薬が使用されているにもかかわらず、治療満足度が40%程度に留まっているパ
ーキンソン病（PD）に着目した。PDは、四大症状と呼ばれる安静時振戦、固縮、
無動、姿勢反射障害といった運動症状と、睡眠障害、認知・精神機能障害、自律
神経障害感覚障害といった非運動症状を特徴とする神経変性疾患である（柳澤,
2008）。その患者数は全世界で600万人強（2015年）、日本で20万人（65歳以上
の100人に1人）（2017年）と報告されており、高齢社会の進展に伴って今後急速
に増加し、2040年には全世界で1300万人弱になると推定されている (Fig. 2)。
現在のPD治療薬は、PDによって失われたドーパミン神経細胞の機能を補う、また
は失われたドーパミン神経細胞に関連して生じた機能低下を補う対症療法であ
り、一時的に症状を改善させるものの、根本から治すというものではなく、完治
は望めない。このため、PDの根本的治療につながる新しい治療薬の開発は喫緊の
課題である。
7
Fig. 2 Estimated and projected number of individuals with Parkinson’s
disease, 1990-2040. Dorsey and Bloem (2018)より引用
8
著者は、これまでに医薬品や健康食品の薬理研究、主に生薬・漢方薬の有効性
と安全性を明らかにすることを目的として、薬理学的手法による薬効評価を行っ
てきた。生薬とは、天然の植物・鉱物・動物などの全部または一部を簡単な加工
のみで薬として用いたもの、漢方薬とは、漢方医学の考え方に基づき、複数の生
薬を定められた量で組み合わせたものである（日本漢方生薬製剤協会, 2001）。
生薬や漢方薬は、単一成分である西洋薬とは異なり、多成分系であることが特徴
で、多種多様な薬理作用を示す。また、漢方薬では複数の生薬を組み合せること
によって、生薬単独よりも薬効の増強、作用の変換および毒性の低減などが生じ
ているものも知られている。今回、著者はその専門分野である生薬・漢方薬で、
難治性疾患であるPDを改善できないか、その手掛かりを探ることを目的に研究を
始めた。数多くの生薬・漢方薬を検討した結果、PDの予防・治療に効果の期待で
きる生薬として、サフランに着目した。サフランはCrocus sativus Linné
（Iridaceae）の柱頭であり、食品添加物（香辛料、黄色の食品着色料、香料）や
医薬品（鎮痛、鎮静、通経剤）として使用されている（Namba, 1980）。サフラン
の化学成分として、150以上の揮発性および不揮発性成分の存在が明らかになって
いる（José Bagur et al., 2017）。その代表的な成分として、色素成分である
crocin-1、crocin-2、crocetin、crocetin dialdehyde（zeaxanthinに由来するカ
ロテノイド）、香気成分であるsafranal、苦味成分であるpicrocrocinが知られて
いる（El Midaoui et al., 2022; Guo et al., 2022）。それらの化学構造をFig.
3に示した。
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Crocin-1
Crocin-2
Crocetin
Crocetin dialdehyde
10
Zeaxanthin
Safranal
Picrocrocin
Fig. 3 Chemical structures of crocin-1, crocin-2, crocetin, crocetin
dialdehyde, zeaxanthin, safranal and picrocrocin.
11
第 2 章では、PDの原因物質と考えられているα-シヌクレイン（αS）凝集体
に対するサフランの作用を検討し、サフランおよびcrocetinをはじめとするその
色素成分がin vitro（試験管レベル）でαS凝集体形成阻害作用および凝集体解
離作用が確認されたことについて記述する（Inoue et al., 2018）。
第 3 章では、第 2 章のin vitro（試験管レベル）で認められたサフランおよ
びcrocetinによるαS凝集体形成阻害作用および凝集体解離作用がin vivo（個体
レベル）で効果を示すか検証するため、脳内や複眼にαSが異常蓄積することが
認められている遺伝子改変ショウジョウバエ（PDモデルショウジョウバエ）にサ
フランまたはcrocetinを摂取させたところ、運動機能低下をはじめとする病態表
現型の出現を抑える効果が確認されたことについて記述する（Inoue et al.,
2021）。
第 4 章では、第 2 章および第 3 章で認められたサフランのαS凝集体形成阻
害作用および凝集体解離作用について、αS以外の凝集性のあるタンパク質（ア
ミロイドβ、タウ、アミリンおよびβ2-ミクログロブリン（β2MG））に対して
も検討したところ、作用強度に違いがあったものの、αSと同様の作用が確認さ
れたことについて記述する（日本国特許第7017238号, 2022; 井上ら, 2019a; 井
上ら, 2019b）（一部未発表データを含む）。凝集性のあるタンパク質は「アミロ
イドタンパク質」と呼ばれ、その凝集体によって引き起こされる疾患の総称は
「アミロイドーシス」と呼ばれている（後藤, 2009; Knowles et al., 2014;
Giorgetti et al., 2018; Benson et al., 2020）。アミロイドーシスは、現在で
も有効性の高い治療法はなく、QOLの低い疾患であることが知られている。アミ
12
ロイドβ、タウ、アミリンおよびβ2MGの凝集体は、主にアルツハイマー病（ア
ミロイドβ、タウ）、Ⅱ型糖尿病（アミリン）および透析アミロイドーシス（β
2MG）の疾患との関連が示唆されている（Giorgetti et al., 2018）。さらに、
サフラン成分のこれらのアミロイドタンパク質凝集体形成阻害作用に関して検討
したところ、特にcrocetinおよびcrocetin dialdehydeが強力であったことにつ
いても記述する（日本国特許第7017238号, 2022; 井上ら, 2019a; 井上ら,
2019b）（一部未発表データを含む）。
第 5 章は、「総括と今後の展望」として、第 2 章から第 4 章までの研究結
果を総括し、更に最新の知見をまとめ、サフランのPDを中心としたアミロイドー
シスに対する可能性について、今後の展望を記述する。
13
第 2 章 αS凝集に対するサフランおよびその成分の作用（in
vitro）
第 1 節 背景
αSは、140アミノ酸からなるタンパク質で、脳内に豊富に存在し、シナプス
可塑性や神経伝達物質の調節に関与していると考えられている（Burré,
2015）。αSはヒト体内において通常単量体（モノマー体）で存在するが、加齢
や酸化ストレスなどの要因により構造変化が起こると、少数のαSが凝集したオ
リゴマー体を形成し、さらにβ-シート構造に富む不溶性の凝集体を形成する
（Burré, 2015）。PD、レビー小体型認知症および多系統委縮症のような神経変
性疾患ではこのαS凝集体の異常蓄積がそれぞれ中脳黒質、大脳皮質および小
脳・脳幹など複数の脳領域で主に認められ、α-シヌクレイノパチーと総称され
ている（Burré, 2015; Goedert, 2001）。これらの関係をFig. 4に示した。
14
Fig. 4 αS凝集体とα-シヌクレイノパチー（パーキンソン病、レビー小体型
認知症、多系統委縮症）.
15
また、αSはアルツハイマー病患者の半数以上において脳内にその凝集体の蓄
積が認められること（Hamilton, 2000）、アミロイドβやαSの凝集体は互いに
他の異常たんぱく質の凝集を促進させることが知られており（Tsigelny et
al., 2008）、アルツハイマー病の発症・進行にも関与すると考えられている。
そのため、αS凝集体形成を阻害すること、または凝集体の解離を促進すること
はこれら疾患の予防・治療に繋がると考えられることから、このような作用を
有する物質の探索に関して多くの研究が行われている（Ji et al., 2016;
Ardah et al., 2014; Ardah et al., 2015）。
サフラン、およびその成分であるcrocin-1とcrocetinにはアミロイドβ凝集
体形成を阻害する作用が報告されており（Papandreou et al., 2006; Ahn et
al., 2011; Ghahghaei et al., 2013）、crocin-1にはタウ凝集体形成の阻害も
報告されている（Karakani et al., 2015）。また、近年サフランには、うつ病
（Ahmadpanah et al., 2019; Mazidi et al., 2016）、不安症（Kell et al.,
2017; Mazidi et al., 2016）、ストレス障害（Kell et al., 2017）および睡眠
障害（Lopresti et al., 2020; Pachikian et al., 2021）といった中枢神経系
疾患に対して有効であったとする臨床報告が相次いでいる。例えばうつ病で
は、前頭皮質、海馬、基底核などの萎縮や神経細胞数の減少といった形態的変
化が生じており、その原因の一つとしてアミロイドβやαSの凝集体による神経
細胞死が挙げられている（山形, 2017）。このような背景から、著者は、サフ
ランにはアミロイドβ、タウのみならずαS凝集体形成も阻害し、αS凝集体が
関与するPD、レビー小体型認知症および多系統委縮症のような神経変性疾患を
改善させる可能性があるのではないかと着目した。本研究では、その手掛かり
16
を探ることを目的にサフランとその成分（色素成分としてcrocin-1、crocin2、crocetin、香気成分としてsafranal）およびcrocetin構造類似体
（hexadecanedioic acid、norbixinおよびtrans, trans-muconic acid）のαS
凝集体形成および凝集体解離に対する作用をin vitroで検討した。
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第 2 節 材料・実験方法
2.2.1 材料
サフラン粉末は松浦薬業 （愛知、日本）より入手した。サフラン粉末を10%
dimethyl sulfoxide (DMSO)/ Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS)
または10% DMSO/蒸留水に懸濁させ、超音波発生装置（Model 2510、Branson、
CT、USA）を用いて25 ℃、30分間超音波抽出後、遠心分離（3000 rpm、10分
間）した上清を試験に使用した。 ...
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