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大学・研究所にある論文を検索できる 「組換えβ-アクチンの発現精製系の構築とDループ変異体(G42A/G46A)の発現及び構造・機能解析」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
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組換えβ-アクチンの発現精製系の構築とDループ変異体(G42A/G46A)の発現及び構造・機能解析

松崎, 瑞季 名古屋大学

2020.10.19

概要

アクチンはすべての真核細胞で発現し、もっとも大量に存在する蛋白質の1 つである。アクチンは、生理的な条件下で螺旋状に重合し、線維状の多量体 F-アクチンとなる。細胞はこのアクチンの重合・脱重合を制御することにより、細胞分裂や細胞運動などの動的変化の駆動力を生み出している。アクチンは単量体 G-アクチンと線維状の多量体F-アクチンの 2 つの状態において、その構造が大きく異なる。大きな差異の 1 つに DNaseⅠ結合ループ(D ループ)の構造の変化がある。D ループは結晶構造中では見えないことが多い。見えている少数の構造では、D-ループは他のアクチンサブユニットか他の蛋白質に結合した状態である。 D-ループが観察される結晶構造や、標識アクチンを用いた実験から D ループは多様な構造をとっていることが知られており、その構造変化の自由度の高さからD ループは多くの局所エネルギーの最小状態を生むことができる高いconformational freedom を持っているとも表現できる。D ループは線維中のサブユニット間のインターフェイスの一部を担っていることから、切断・酸化すると線維中のサブユニット間の相互作用が影響を受け、アクチン線維の安定性が低下することが報告されている。しかし、D ループのconformational freedom がアクチンのダイナミクスにどのように寄与しているのかは明確に示されていない。本研究は D ループの conformational freedom とアクチンダイナミクスの関係について調べることを目指した。

蛋白質の機能発現機構について、残基レベルでその詳細を知る手法としては、機能に関与する領域に変異を導入した変異体の機能解析が有用である。高等生物アクチンについては、近年昆虫細胞を用いた発現系の構築が報告され、変異体による機能解析が進められてきている。本研究では始めに、筆者の所属する研究室で構築されたバキュロウイルス-昆虫細胞を用いたヒト心筋α-アクチンの発現系を基に、非筋細胞β-アクチンの発現精製系を構築した。α-アクチンは筋細胞で発現し筋収縮に関与する一方、β-アクチンはほとんどすべての非筋細胞で発現しており、細胞の細胞分裂や細胞運動など動的機能に関与している。本発現精製系の構築にあたって、上記心筋α-アクチン発現精製系では N末端に付加したままであったStrepTagII 配列とプロテアーゼ認識配列の切断を可能とするべく、プロテアーゼを Factor Xa から TEV プロテアーゼに変更し、タグとの間にスペーサ(SS)を挟むように設計を変更した。

20mM-Tris 条件にて発現アクチンの抽出を行い、同条件にてアフィニティータグを使用した精製 を行うことによりコフィリンを含むアクチン結合蛋白質を除くことができた。設計を変更したことで、タグの切断が可能となった。精製段階においてNative-Page を行うことによりTEV 処理とその後の精製によりタグの残ったアクチンを取り除けていることを精製段階で確認できた。今回得られた精製組換えアクチンは、アクチンの特徴である重合・脱重合能を備えている。また電子顕微鏡像による解析からも、組織から精製したアクチンの構造と遜色ない解析結果が得られたことから、この発現系で得られる組換えアクチンは機能解析に使用しうると判断した。
次いで、アクチン変異体を作製し、構造及び機能の解析を行った。D ループのアミノ酸配列は種間で高度に保存されており既知のアクチン配列全てに 3 つのグリシンが含まれている。グリシンは蛋白質に含まれる 20 種類のアミノ酸のうちで一番小さく、D ループの conformational freedom に大きく関わっている可能性が考えられたことから、D ループに位置する 42 番目と 46 番目のグリシンをアラニンに変異させた二重変異体の発現を試みた。この二重変異により、野生型アクチンのとりえた構造のいくつかをとることができなくなり、D ループがとりうる立体構造の範囲が抑制されると考えられる。発現に先立ち、現行のアクチンサブユニット間結合を示した構造(PDB ID: 6KP8)を基に、2 つのグリシンをアラニンに変異させた変異体のモデルを構築すると、変異体のアラニン側鎖はアクチンサブユニットの他の領域と衝突しないことが確認できた。そのため、この変異体はサブユニット間の相互作用に影響せずに、D ループの conformational freedom を抑制すると仮定した。

発現した変異体の構造及び機能解析の結果、変異体と野生型の臨界濃度(F-アクチンと G-アクチンの間の自由エネルギーを直接反映している)に大きな差は認められず、線維構造にも違いは認められなかった。それにもかかわらず、変異体の B 端側の重合速度および脱重合速度は野生型に比べ低下していた。アクチン結合蛋白質であるコフィリンの結合を比較してみると、変異体ではアクチンに対し同濃度のコフィリンを加えた際にその結合は抑制されたが、過剰量のコフィリンを加えた際には野生型と同様にアクチン1 分子に対しコフィリンが1 分子の割合で結合したアクチン線維であるコフィラクチンを形成した。これは、導入した変異が、コフィリン結合の様式を大きく変えずにコフィリン結合を弱めていることを示している。

アクチン単独での実験結果から、モデルで仮定した通り、導入した変異はアクチン線維のサブユニット間結合には影響を与えていないと考えられる。変異体の B 端における重合・脱重合速度の減少は、 D-loop のconformational freedom が、アクチン分子の動態に直接影響を与えることを示唆する最初の証拠である。また、コフィリンを加えた際の実験結果は、近年のアクチン線維に対するコフィリンの結合モデルと矛盾しない。このモデルではアクチンに対するコフィリンの結合には、D ループがアクチン線維内で隣接するサブユニットから解離することが必要であるとしており、変異導入により Dループの conformational freedom が抑制された場合、コフィリンの結合速度は低下すると考えられる。それに対し D ループはコフィラクチンの線維中の他の箇所に接触していないことから、コフィラクチンからのコフィリンの解離速度については変異導入の影響を受けないと考えられるため、全体としてはコフィリンの結合は抑制される。

コフィリンはそのアクチン切断・分解効果により、細胞内のアクチンダイナミクスの加速に重要である。本研究において、変異体へのコフィリンの結合は熱力学的に低下した。変異導入の重合・脱重合への影響と合わせて、筆者はD ループの conformational freedom が細胞内のアクチンダイナミクスの速度を直接調整している可能性が高いと考えている。この仮説の検証には、他の D ループ変異体を作製し、導入した変異の影響を解析することが必要であるが、構造変化の自由度がアクチンダイナミクスに影響を与える可能性を示した本研究は、アクチンの構造動態の理解、conformational freedom の蛋白質機能への影響の理解に寄与すると信じている。

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