若年齢および成熟マウスにおける高気圧酸素療法が骨再生へ及ぼす影響について

概要

論

文 の

全 文 要 約

若年齢および成熟マウスにおける高気圧酸素療
法が骨再生へ及ぼす影響について

主指導教員：谷本 幸太郎教授
（医系科学研究科 歯科矯正学）
副指導教員：加来 真人教授
（医系科学研究科 生体構造・機能修復学）
副指導教員：柴 秀樹教授
（医系科学研究科 歯髄生物学）

泉野

尋

（医歯薬保健学研究科 医歯薬学専攻）

高気圧酸素療法（HBO）とは、大気圧より高い気圧環境の中で、酸素を吸入することにより病
態の改善を図ろうとする治療のことで、チャンバー内で２絶対気圧以上の圧力下にて 100%酸素
を１時間以上吸引する治療法と定義されており、放射線性骨壊死や糖尿病性壊疽、減圧症や急性
一酸化炭素中毒などの治療法として用いられている。近年、HBO は創傷部位における新生骨の
形成を促すことで骨折や骨移植時の治癒促進に有効であるとされており、動物実験では、成熟し
たウサギの頭頂骨に自然に治癒が生じない大きさの骨欠損に対して HBO を行った群では骨再
生量が増加したことが報告されている。しかしながら、若年齢の生体に対する HBO の効果につ
いては未だ明らかになっていない。そこで本研究では、HBO が若年齢および成熟マウスの頭蓋
骨欠損部の骨再生に与える影響を比較するとともに、治癒促進のメカニズムを探索することとし
た。また、骨再生は血管新生と密接に関連しており、HBO により血管新生が促進されることが
考えられている。しかしながら、血管新生の誘導因子として知られる vascular endothelial
growth faxtor（VEGF）の発現は HBO により低下することが報告されていることから、我々は
basic fibroblast growth factor（bFGF）の発現が血管新生に関与していると仮説をたて、検討
を行った。また、VEGF の発現に影響を及ぼすとされている HIF1-α の発現に及ぼす HBO の影
響について検討を行った。
実験 1 では実験動物を用い、HBO の骨再生および血管新生へ与える影響を検討した。３週齢お
よび 32 週齢の C57BL6J マウスの頭蓋骨に３種混合麻酔下にて自然治癒が生じないとされる直
径 6.0 mm の骨欠損部をトレフィンバーにて作製し、HBO 群と対照群とに分類した。HBO 群
は 2.5 絶対気圧の圧力下にて 100%酸素中に 90 分間曝露する過程を週５回 12 週間行った。対照
群は同期間ゲージ飼育のみを行った。マイクロ CT を実験開始４週後以降２週毎に撮影し、３次
元再構築ソフトウェア ZedView、３次元データ処理ソフトウェア Rapid Form、３次元データモ
デリングソフトウェア Free Form を用いて再生骨体積の計測を行った。次に、再生骨周囲に出
現する血管について７日ごとに毛細血管血流スコープ B scan-z にて撮影し、画像処理ソフトウ
ェア image j を用いて血管面積を測定し、２群間の比較を行った。また、HBO による骨欠損部
周囲における血管新生に及ぼすメカニズムを検討するため、再生骨周囲の滲出液をペーパーポイ
ントを用いて回収し、滲出液中の VEGF および bFGF のタンパク発現量を ELISA 法にて検討
した。さらに、組織学的観察として、実験開始 12 週後に実験動物の屠殺を行い、厚さ７µm の
前頭断連続パラフィン切片を作製し、tartrate-resistant acid phosphatase（TRAP）染色によ
る破骨細胞数の計測と再生骨面積の比較を行った。
実験２では HBO による骨芽細胞の骨分化および血管新生促進メカニズムの解析を MC3T3-E1
細胞を用いて行った。MC3T3-E1 細胞を HBO に曝露させ、ALP 染色、アリザリン染色および
ALP 定量、カルシウム定量を行い、対照群との比較を行った。次にオステオカルシン、I 型コ
ラーゲン、VEGF 、bFGF 、HIF1-α の遺伝子発現に与える HBO の影響について定量 PCR 解
析を行った。また、HBO による骨芽細胞の ATP 合成量へ与える影響をルミノメーターを用い
て検討した。この結果より、以下のことが明らかになった。

1. 若年齢、成熟マウスともに HBO によりマウス頭蓋骨欠損部周囲の骨再生が有意に促進され
た。また、若年齢マウスでは成熟マウスと比較して早期の段階から骨再生の促進が認められ
た。HBO により骨欠損部周囲の VEGF の発現は HBO 曝露から早い時期に有意に減少して
いたが、bFGF の発現は有意に亢進した。再生骨面積および再生骨周囲の破骨細胞数は HBO
の曝露により有意に増加した。
2. MC3T3-E1 細胞への HBO 曝露によりオステオカルシン、I 型コラーゲン、bFGF の遺伝子
発現は有意に亢進した。また、VEGF、HIF1-α の遺伝子発現は HBO により有意に減少し、
MC3T3-E1 細胞の ATP 合成量は HBO により有意に亢進した。
以上の結果から、HBO は骨再生能力を促進させ、その効果は若年齢であるほどより早期に現れ
ることが示された。また、HBO は血管新生を促進させるが、HBO 曝露初期では VEGF の代わ
りに bFGF が作用している可能性が示唆された。