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Conditioned media from mesenchymal stromal cells and periodontal ligament fibroblasts under cyclic stretch stimulation promote bone healing in mouse calvarial defects

荻須, 宏太 名古屋大学

2021.04.23

概要

【緒言】
　外傷や腫瘍などに起因する骨欠損の再建には自家骨や同種骨、異種骨、人工骨が用いられているが、自家骨であれば採取量の制限や採取部の侵襲、同種骨や異種骨、人工骨では感染やアレルギーのリスクがしばしば問題となる。我々はこれまでヒト間葉系幹細胞（hMSCs）を骨欠損部に移植し良好な結果を得てきたが、細胞採取時の侵襲や感染のリスク、細胞の腫瘍化などの問題点が指摘されている。そこで、細胞移植に代わる方法として幹細胞培養後の培養上清（conditioned medium以下CM）を用いる方法を考案し、ラット頭蓋骨欠損部にヒト骨髄由来間葉系幹細胞由来培養上清（hMSC-CM）を投与することで骨形成が促進されることを報告した。一方、過去の報告では細胞培養時に機械的刺激を加えることでCM中の成長因子の組成が変化し、特に伸展刺激下で培養すると骨形成因子の発現が上昇することが知られている。臨床では整形外科、顎顔面外科領域における仮骨延長術や、矯正歯科治療における歯の移動など機械的刺激を応用した治療が実施されており、機械的刺激と骨形成は関わりが深い。本研究の目的は伸展刺激を加えて得たCMが、通常条件で得たCMよりも骨再生に適していることを示すことである。

【材料および方法】
　hMSCsおよびヒト歯根膜線維芽細胞（HPLFs）をそれぞれシリコンチャンバーに播種し、70~80%コンフルエントに達した後、伸展刺激群（以下Stretch群）は伸展周期0.17ヘルツ（10往復/min）、伸展率5％の刺激を与えながら、非伸展群（以下Non-stretch群）については通常条件下でそれぞれ24時間培養した。その後、各細胞のStretch群、Non-stretch群のCMおよび細胞を1500rpm/5minの遠心分離によりそれぞれ回収した。細胞はreal time-qPCRを、CMはELISA、Tube formation assay、Alizarin red S染色による解析で評価した。in vivoでは10週齢、オスのICRマウスを用いて生検用トレフィンパンチにより直径2mmの頭蓋骨欠損モデルを作成した。欠損部にコラーゲンスポンジを担体として各細胞由来のStretch群CM（以下S-CM）、Non-stretch群CM（以下N-CM）およびDMEM（DMEM群）を投与した。欠損のみのDefect群についても設定した。2週間後に免疫染色で血管新生を、4週間後にμCTおよびヘマトキリシンエオジン染色で骨形成についてそれぞれ評価した。

【結果】
　細胞のreal time-qPCRではHPLFs、hMSCsともにStretch群で骨形成因子および血管新生因子の発現が上昇していた（Figure1）。CM中の骨形成，血管新生因子含有量はELISAでは両細胞ともStretch群でBMP2/4、VEGF-Aが増加、HPLF-CMではPDGF-AAもStretch群で増加しており、タンパクレベルでも有意な差を認めた。細胞群間の比較ではBMP2のS-CM群およびVEGF-Aの両群に有意差を認めた（Figure2）。Tube formation assayでは各細胞ともN-CM群と比較してS-CM群では管腔形成部の面積、長さ、枝分かれ数の全項目において増加を認めた。また細胞間の比較においてもHPLFsと比較してhMSCsで全項目での増加を認めた（Figure3）。Alizarin red S染色では両細胞ともN-CM群と比較してS-CM群では染色度が高く、石灰化能は伸展刺激により上昇していた。また、細胞間での比較ではHPLFsと比較してhMSCsで石灰化が亢進していた（Figure4）。in vivoにおいて、μCTでの評価ではDefect群、DMEM群と比較してN-CM群、S-CM群とも骨体積比は増加しており、両細胞ともS-CM群の方がN-CM群より増加を認めた。一方でHPLFs群とhMSCs群との間では差を認めなかった（Figure5）。免疫染色ではDefect群、DMEM群と比較するとN-CM群、S-CM群とも新生血管の面積は増加しており、両細胞ともS-CM群の方がN-CM群と比較して有意に増加していた。HPLFsとhMSCsとの間では差を認めなかった（Figure6）。

【考察】
　in vitroにおいて過去の報告と同様にいずれの細胞においてもCM中の骨形成因子、血管新生因子が伸展刺激により増加し、石灰化能，管腔形成能の評価においてもStretch群、Non-stretch群の間で有意差を認め、in vivoでも各細胞においてN-CM群と比較してS-CM群で骨形成、血管新生が有意に増加していたことから伸展刺激を加えることで骨再生に有効なCMが得られたことが明らかになった。過去の報告では細胞種や、伸展刺激の強度により上昇する因子や上昇の度合いは様々であり、これらの条件を変化させる事でより有効なCMを得られる可能性がある。本研究では従来用いてきたhMSCsに加え、歯根膜由来であるHPLFsを用いた。これは歯科矯正治療における歯の移動では牽引側で骨の添加が見られることから、高い骨形成能を有する可能性が考えられたためである。結果、in vitroにおいてhMSCsには劣るもののHPLFsでもCMの石灰化能、管腔形成能を認め、伸展刺激によりさらに上昇した。一方in vivoではhMSCsとHPLFsとの間の比較において骨形成、血管新生能に差は認めなかった。今回観察した以外の因子が関わっている可能性があると考えられ、今後さらにマイクロアレイやサイトカインアレイ等で網羅的な解析を検討する必要があると考えられた。本研究ではCM中の骨形成、血管新生因子の含有量がともに増加し、in vivoでも投与部の骨再生、血管新生がともに増加していた。過去の報告でも血管新生は幹細胞や成長因子の輸送などを介して骨再生を促進する重要な役割を担っていることが報告されていることから、本研究においても血管新生が骨再生に重要な役割を果たした事が示唆された。

【結論】
　伸展刺激下で得た細胞培養上清が血管新生を促進することで骨再生を促す事が示された。

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