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FUS R495X 変異によるALS発症機構の解明

河原, 大貴 北海道大学

2020.03.25

概要

本研究は FUS R495X 変異による ALS 発症機構の解明に向け、R495X 変異体の構造体形成分子機構の解明と R495X 構造体形成による細胞内変化について明らかにすることを目的に解析を行った。

R495X 構造体形成分子機構に関しては以下の点を明らかにした。

1) 各 RNA 結合ドメインの欠損変異体を用いた解析から、Gly-rich,RGG１,RGG２ドメインが構造体形成に必須であることを示した。また、ZnF ドメインが構造体形成に一部寄与することを示した。さらに、CLIP 法を用いた解析から、構造体を形成しない欠損体であるΔGly-rich, ΔRGG1, ΔRGG2 ではR495X 変異体と比較して RNA との結合量が約 9 割減少することを示した。

2) 精製系を用いた解析から FUS は RNA と共に相転移し、さらに FUS の相転移を RNA が促進することを示した。この結果より、R495X 変異体は RNA との相互作用を介して相転移が促進された結果、構造体を形成することが示唆された。


以上の結果から、FUS はRNA と相互作用することで相転移する性質をもち、R495X 変異体は Gly-rich, RGG１, RGG２ドメインを介して RNA と相互作用することにより相転移が促進された結果、構造体を形成すると考えられる。

本研究の解析から、FUS R495X 変異体の構造体形成に RNA との結合が寄与することを示した。しかし FUS WT と R495X 変異体とでは RNA との結合量には有意な変化は観察されなかった（Figure 11）。この結果から、R495X の構造体形成には、①変異による細胞質の局在増加、そして②細胞質における RNA との相互作用、の 2 点が重要であることが示唆される。細胞質への局在増加が R49X 構造体形成に寄与する機構として、いくつか可能性が考えられる。

まず、結合する RNA の違いにより相転移への影響が異なる可能性が考えられる。これまで所属研究室では、WT は核内にて主に pre-mRNA のイントロン領域に結合し、R495X 変異体は細胞質にて mRNA の 3’UTR および CDS と結合することを示している (Nakaya T and Maragkakis M. 2018)。これら結合 RNA の違いにより FUS の相転移に与える影響が異なる可能性が考えられる。実際、Stress を受けた際に形成される Stress granule において、特異的に排除される RNA 分子が存在することも報告されており (Fay MM. and Anderson PJ.2018)、RNA の構造、配列によって相転移に与える影響が異なる可能性は十分に考えられる。今後、細胞分画法等を用い核、細胞質内ごとの RNA を抽出し FUS の相転移への影響について検証することで、明らかにすることができると予想される。

また、その他の可能性として、核内と細胞質において FUS の RNA との結合様式が異なる可能性も考えられる。CLIP 法を用いた結合RNA 量解析の結果、興味深いことに Gly-rich, RGG１, RGG２ドメインの欠損変異体全てで、R495X 変異体と比較して RNA との結合量が 9 割近く減少していた。この結果から、R495X 変異体は Gly, RGG1, RGG2 ドメイン一つごとに RNA を認識しているのではなく、３つのドメイン全てを介して構造的に RNA を認識すると考えられる。現時点ではこの RNA の結合様式が構造体形成にどのように寄与するのかは未知である。しかし、今後 FUS 全長を基にした各 RNA 結合ドメインの欠損変異体を用いた同様の解析を行い、核内と細胞質とで RNA との結合様式が大きく異なっていた場合、RNA の結合様式の違いが構造体形成に寄与する可能性も考えられる。

また、RNA 以外の因子により相転移が制御されている可能性も考えられる。相転移の制御に関する報告は近年盛んに研究が行われており、様々な因子の関与が示唆されている。例を挙げると、本研究で着目した RNA 以外にも ATP や塩濃度、温度等が寄与することが報告されており (Kang J et al., 2018 )、これら因子の差異により細胞質においては環境的に相転移が起こりやすい場が構築されている可能性も考えられる。

また、反対に核内においては何等かの因子が相転移を抑制している可能性も考えられる。 ALS の原因因子であるTDP-43, FUS , hnRNPA 等の RNA 結合タンパク質は、共通して天然変性領域をもち、相転移する性質をもつ(Franzmann TM and Alberti S. 2019)。これら分子は、主に核内に存在するため、核内ではそれらタンパク質が密集して存在すると予想される。相転移は天然変性領域を持った分子が局所的に高密度に存在することで引き起こされることから (Patel A et al., 2015) 、核内は極めて相転移が起こりやすい場が形成されていると考えられる。しかし、DNA 損傷時等を除き、これらタンパク質の構造体は通常観察されない。従って、核内においては何等かの因子が抑制的に相転移を制御する可能性が考えられる。実際、核内輸送受容体Kapβ2 が相転移を抑制することが報告されており (Guo L et al ., 2018)、このような分子の存在により核内においては不必要な相転移を抑制する機構が存在する可能性も考えられる。

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